廖巧明, 陶 晗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌,可以寄生于人和動(dòng)物腸道[1]。它與一系列傳染病有關(guān),例如新生兒革蘭氏陰性膿毒癥、腦膜炎和腦膿腫等[2]。阪崎腸桿菌近年來(lái)在奶粉中檢出率逐年增加[3-4],2013—2017年,白銀市嬰幼兒食品中致病菌的檢出率為17.42%,主要為蠟樣芽胞桿菌和阪崎腸桿菌[5]。

奶粉常見(jiàn)的加工工藝在加工過(guò)程中一定程度上降低奶粉的口感,并對(duì)營(yíng)養(yǎng)素造成一定的損失。因此,在保證奶粉質(zhì)量的同時(shí),檢出食品中的阪崎腸桿菌及對(duì)其進(jìn)行減控成為研究熱點(diǎn)。目前,食品中的殺菌技術(shù)可以分為熱殺菌和冷殺菌[6]。因?yàn)闊釟⒕鷷?huì)破壞一些熱敏性食品的色、香、味及營(yíng)養(yǎng)成分等,降低產(chǎn)品質(zhì)量，所以冷殺菌技術(shù)的研究日益活躍,例如脈沖電場(chǎng)、臭氧、超聲、輻照和超高壓等殺菌技術(shù)[7-9]。其中,食品中超高壓殺菌是將食品物料密封于食品級(jí)材料或置于無(wú)菌壓力系統(tǒng)中(以水或其他流體作為傳遞壓力的介質(zhì)),在100～1 000 MPa壓力下作用一段時(shí)間后使食品物料達(dá)到滅菌要求[10]。研究表明,超高壓處理可以破壞食品貯藏期間細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)[11],達(dá)到保證食品貯藏期的安全性和感官特性的目的[12]。

近年來(lái),隨著生物信息學(xué)的發(fā)展,在脅迫方面,利用高通量測(cè)序技術(shù),通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究細(xì)菌在不同因素脅迫后差異基因的分析成了手段之一[13-17]。通過(guò)DNA隨機(jī)片段化處理、接頭處理、克隆等手段,可以同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序。該方法具有通量大、高靈敏度、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)[18-22];文獻(xiàn)[23]使用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)分析富硒條件下釀酒酵母內(nèi)在分子機(jī)制;文獻(xiàn)[24]探究原兒茶酚對(duì)阪崎腸桿菌毒力因子的抑制作用,質(zhì)量濃度為2 g/L的原兒茶酚可以達(dá)到降低細(xì)菌黏附等能力,并導(dǎo)致9種與毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄量下調(diào);文獻(xiàn)[25]通過(guò)測(cè)序技術(shù)分析副干酪乳桿菌SMN-LBK在乙醇脅迫下轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化,篩選出與細(xì)胞壁生物合成相關(guān)的6個(gè)差異基因,為乳酸桿菌的耐乙醇機(jī)制提供了理論依據(jù)。由于從RNA水平探究超高壓對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌機(jī)理研究目前尚少,基于此,本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)不同壓強(qiáng)處理后的阪崎腸桿菌進(jìn)行測(cè)序,基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)采用生物信息學(xué)對(duì)阪崎腸桿菌基因的表達(dá)差異進(jìn)行分析,對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,為今后超高壓在食品工業(yè)的應(yīng)用提供一定的分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌株(阪崎腸桿菌 ATCC 29544)購(gòu)自于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,并保存在-20 ℃冰箱中。

1.2 菌株培養(yǎng)

取50 μL阪崎腸桿菌液(ATCC 29544)接種于5 mL的滅菌營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基(蛋白胨5.0 g,牛肉浸取物3.0 g,NaCl 5.0 g,蒸餾水1.0 L)中,并在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后,從中取2%的接種量接種已活24 h的阪崎腸桿菌于10 mL已滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中,在37 ℃條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。

1.3 超高壓處理

將5 mL的阪崎腸桿菌(約108CFU/mL)分裝到10 mL聚乙烯塑料袋中,包裝封口后進(jìn)行不同壓強(qiáng)的超高壓處理(50、100、200、300、400 MPa),處理時(shí)間為10 min。

1.4 存活量測(cè)定

將超高壓處理后的菌液在8 000 r/min條件下離心3 min,取其上清液與相同體積的0.85%生理鹽水重懸,并吸取0.1 mL重懸液于無(wú)菌的0.85%生理鹽水中梯度稀釋,然后在營(yíng)養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基(蛋白胨5.0 g,牛肉浸取物3.0 g,NaCl 5.0 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1.0 L)上涂布,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜,并計(jì)算存活量,每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。

1.5 細(xì)菌總RNA提取

采用DEPC處理所有實(shí)驗(yàn)相關(guān)耗材,根據(jù)制造商的說(shuō)明(TIANGEN),使用RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit從阪崎腸桿菌細(xì)胞中提取總RNA,并使用DNase Ⅰ(TaKara)去除基因組 DNA。RNA樣品提取后分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop和Agilent 2100分析RNA降解程度以及是否有污染,檢測(cè)RNA的純度(OD260/OD280)和RNA的完整性。經(jīng)過(guò)檢測(cè)后才用高質(zhì)量的RNA樣品來(lái)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),并上機(jī)測(cè)序。

1.6 文庫(kù)制備和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

樣品檢測(cè)合格后,通過(guò)Ribo-zero試劑盒去除rRNA來(lái)富集mRNA。隨后加入裂解液將mRNA打斷成短片段,以mRNA為模板,用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成一鏈cDNA,然后加入緩沖液、dNTPs(dNTP中的dTTP用dUTP取代)、DNA polymerase Ⅰ和RNase H合成二鏈cDNA,用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA,之后用USER酶降解含有U的cDNA第二鏈。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭,再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物[26],得到最終文庫(kù)。

文庫(kù)構(gòu)建完成后,先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量,稀釋文庫(kù)質(zhì)量濃度至1 ng/μL,隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的插入片段長(zhǎng)度(insert size)進(jìn)行檢測(cè),insert size符合預(yù)期后,使用qPCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度>2 nmol/L),以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后,把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行HiSeq/MiSeq檢測(cè)[27]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

HTSeq v 0.6.1用于分析每個(gè)樣品的基因表達(dá)水平,并根據(jù)基因長(zhǎng)度計(jì)算每個(gè)基因的FPKM,然后將reads計(jì)數(shù)映射到該基因上。用DESeq進(jìn)行差異表達(dá)分析,DESeq提供統(tǒng)計(jì)例程,基于負(fù)二項(xiàng)分布模型進(jìn)行差異基因的表達(dá)分析,以P<0.05、|lb(差異倍數(shù))|≥2為篩選條件,篩選獲得實(shí)驗(yàn)組與空白組之間表達(dá)差異的基因。利用GOseq R對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論GO富集分析,修正基因長(zhǎng)度偏倚。P校正值小于0.05時(shí),認(rèn)為差異表達(dá)基因顯著富集。使用KOBAS軟件檢測(cè)差異表達(dá)基因在KEGG通路中的富集情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同壓強(qiáng)對(duì)阪崎腸桿菌的影響

不同超高壓壓強(qiáng)對(duì)阪崎腸桿菌的影響如圖1所示。圖1中，*表示P<0.05;***表示P<0.001。由圖1可知,以未進(jìn)行超高壓處理的阪崎腸桿菌作為對(duì)照組,以壓強(qiáng)條件為50、100、200、300、400 MPa對(duì)阪崎腸桿菌進(jìn)行超高壓處理,未處理時(shí),阪崎腸桿菌每毫升活菌數(shù)為109.39CFU;在50 MPa條件下,阪崎腸桿菌每毫升活菌數(shù)下降至109.25CFU,存活率為98.51%,隨著處理壓強(qiáng)的增加,阪崎腸桿菌的存活數(shù)減少;在400 MPa條件下,阪崎腸桿菌每毫升活菌數(shù)下降至106.27CFU,存活率為66.77%;50 MPa時(shí),0.01

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

Phred指每個(gè)堿基測(cè)序錯(cuò)誤率,其測(cè)序堿基質(zhì)量值(Phred score,Qphred)通過(guò)公式轉(zhuǎn)化得到;Phred分值、不正確的堿基識(shí)別率、正確的堿基識(shí)別率以及Q-score的對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表1所列。

表1 堿基識(shí)別與Phred分值之間的簡(jiǎn)明對(duì)應(yīng)關(guān)系

原始測(cè)序序列(sequenced reads,raw reads)中含有帶接頭的、低質(zhì)量的讀長(zhǎng)(reads)以保證信息分析質(zhì)量,必須對(duì)原始數(shù)據(jù)(raw reads)過(guò)濾,得到過(guò)濾數(shù)據(jù)(clean reads),后續(xù)分析都基于clean reads，測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2所列。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2中,GC百分比表示堿基G和C的數(shù)量總和占總的堿基數(shù)量的百分比;Q20表示原始數(shù)據(jù)中Phred數(shù)值大于20的堿基數(shù)量占總堿基數(shù)量的百分比;Q30表示原始數(shù)據(jù)中Phred數(shù)值大于30的堿基數(shù)量占總堿基數(shù)量的百分比。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,本文共獲得108 643 634個(gè)原始數(shù)據(jù),對(duì)原始片段進(jìn)行過(guò)濾處理后得到106 852 708個(gè)過(guò)濾數(shù)據(jù)。由表1可知,對(duì)照組和50 MPa處理組的Q20值均大于97%,Q30值均大于91%,且GC百分比分別為55.84%、55.48%。表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量好、準(zhǔn)確性高,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.3 基因表達(dá)分析

FPKM(expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions basepairs sequenced)是最常用的基因表達(dá)水平估算方法[28],是指每百萬(wàn)片段中來(lái)自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的片段數(shù)目,被用來(lái)增加不同基因、不同實(shí)驗(yàn)估計(jì)基因的可比性。

FPKM結(jié)果見(jiàn)表3所列。

表3 不同表達(dá)水平區(qū)間的基因數(shù)量

由表3可知,處理組的基因PFKM在1～3區(qū)間最低,每個(gè)基因的表達(dá)水平在2.42%～5.75%范圍內(nèi);基因平均表達(dá)量在FPKM>60區(qū)間最高,每個(gè)基因的表達(dá)水平在28.11%～54.00%范圍內(nèi),說(shuō)明多數(shù)基因均高水平表達(dá),數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[29]。

2.4 差異基因表達(dá)分析

差異表達(dá)基因的火山圖如圖2所示。

由圖2可知,與對(duì)照組相比,在50 MPa處理?xiàng)l件下,差異表達(dá)的基因總共635個(gè),其中:上調(diào)基因481個(gè);下調(diào)基因154個(gè)。

2.5 差異基因功能分析

差異基因GO富集情況見(jiàn)表4所列。

50 MPa條件下差異基因GO富集分析如圖3所示。

GO富集分析以閾值P<0.05為依據(jù)評(píng)價(jià)差異基因的主要生物學(xué)功能, GO富集分析分為分子功能(molecular function)、生物過(guò)程(biological process)和細(xì)胞組成(cellular component)3個(gè)部分。由圖3和表3可知,50 MPa和未處理組相比,生物過(guò)程組細(xì)胞定植、定位確立以及轉(zhuǎn)運(yùn)為顯著富集GO term,分別涉及159、156、155個(gè)基因;分子功能組中細(xì)胞膜部分為顯著富集GO term,涉及相關(guān)基因180個(gè),而細(xì)胞組成沒(méi)有顯著富集GO term。

表4 差異基因本體(GO)富集情況

2.6 差異基因的KEGG富集分析

差異基因的KEGG富集分析散點(diǎn)圖如圖4所示。差異基因的KEGG富集情況見(jiàn)表5所列。

表5 差異基因KEGG富集情況

在生物體內(nèi),不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能,通過(guò)通路顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)傳導(dǎo)途徑[30]。KEGG是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫(kù)。在KEGG富集散點(diǎn)圖中,KEGG富集程度通過(guò)富集因子、q值和富集到此通路上的基因數(shù)來(lái)衡量。其中富集因子指該通路中富集到的差異基因數(shù)與注釋基因數(shù)的比值。富集因子越大,表示富集的程度越大。

q值是做過(guò)多重假設(shè)檢驗(yàn)校正后的值,其取值范圍為[0,1],越接近于0,表明富集越顯著。由表5可知,差異顯著基因主要參與了腺苷三磷酸結(jié)合盒ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter)、雙組分調(diào)控系統(tǒng)(two-component system)、硫代謝(sulfur metabolism)、氮代謝(nitrogen metabolism)等。

腺苷三磷酸結(jié)合盒ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白差異顯著基因見(jiàn)表6所列。

由圖4和表6可知,富集到腺苷三磷酸結(jié)合盒ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路上的基因有50個(gè),呈顯著富集;富集到硫代謝通路上的基因有20個(gè);富集到氮代謝、細(xì)胞趨化性通路上的基因有10個(gè);富集到鐵團(tuán)非核糖體肽的生物合成通路上的基因有8個(gè);富集到雙組分調(diào)控系統(tǒng)、微生物在不同環(huán)境中的代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路的基因分別有30、30、5個(gè)。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)是一個(gè)與結(jié)構(gòu)相關(guān)的吸收和外運(yùn)系統(tǒng)的超家族,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白核心是跨膜結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)構(gòu)域,它參與了大量物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,因此對(duì)細(xì)菌的生命活動(dòng)十分重要[31]。由表6可知,超高壓的處理導(dǎo)致ES50組相對(duì)ESC組,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中kpsE/T、ugpA/B/C/E等基因顯著上調(diào)表達(dá),基因glnH/P、gltI/K/J等基因顯著下調(diào)。差異表達(dá)的基因參與調(diào)控莢膜、磷壁酸、氨基酸等。

莢膜是細(xì)菌在生命活動(dòng)中會(huì)在細(xì)胞的表面形成一層包裹菌體的黏液樣物質(zhì)。莢膜多糖在細(xì)菌生命活動(dòng)中起重要作用,如維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、保護(hù)性免疫、細(xì)菌毒力等[32]。kpsE是莢膜多糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)滲透酶蛋白,kpsT是莢膜多糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白,兩者在50 MPa超高壓處理后顯著上調(diào),在加速莢膜多糖形成的過(guò)程也產(chǎn)生了毒素,這是阪崎腸桿菌在逆環(huán)境中的一種自我保護(hù)方式。

文獻(xiàn)[33]研究發(fā)現(xiàn),致病性大腸桿菌△kpsED缺失株在雞的體內(nèi)定植能力下降并失去致病力,進(jìn)一步證明了莢膜多糖與細(xì)菌致病性的關(guān)系。

表6 腺苷三磷酸結(jié)合盒ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白差異顯著基因

磷壁酸根據(jù)醇組分不同可分為核糖醇壁酸(核糖醇-5-磷酸的聚合物)和甘油磷壁酸(sn-甘油-3-磷酸的聚合物)。磷壁酸參與到細(xì)胞多種生命活動(dòng)中,例如細(xì)菌的黏附和定植、細(xì)胞自溶等。本研究發(fā)現(xiàn)ugpA/B/C/E基因顯著上調(diào),說(shuō)明阪崎腸桿菌在超高壓的脅迫下,ugpA/B/C/E基因被激活,加速sn-甘油-3-磷酸的形成。由表6可知,與無(wú)機(jī)鹽轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān)的基因也發(fā)生了顯著上調(diào),如cysP/U/W、ntrA/B/C等,文獻(xiàn)[34]研究表明,副溶血性弧菌在超高壓的脅迫下,與無(wú)機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、ABC型磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、生物過(guò)程調(diào)控相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著提高,并認(rèn)為這些有助于菌株對(duì)超高壓的耐受能力,與本研究的結(jié)果一致。

氨基酸在細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)中至關(guān)重要。由表6可知,與氨基酸相關(guān)的基因發(fā)生了顯著下調(diào),如與賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸相關(guān)的argT,與組氨酸相關(guān)的hisJ,與谷氨酰胺相關(guān)的glnH/P,與谷氨酸、天冬氨酸相關(guān)的gltI/K/J等,這些基因的下調(diào)表明在超高壓的脅迫下,阪崎腸桿菌對(duì)氨基酸的分解和利用能力降低。與肽相關(guān)的基因也發(fā)生了顯著下調(diào),表明在超高壓脅迫下,阪崎腸桿菌對(duì)一些蛋白質(zhì)的合成能力減弱,影響了自身的生長(zhǎng)代謝。具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本研究采用Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái),對(duì)阪崎腸桿菌高壓(50 MPa)條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析,并探討超高壓殺菌的分子機(jī)制,為后續(xù)進(jìn)一步qPCR驗(yàn)證提供了方向。研究表明,超高壓條件下,50 MPa與0 MPa相比,上調(diào)表達(dá)差異基因363個(gè),下調(diào)表達(dá)差異基因395個(gè)。這些差異基因主要富集在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氮代謝、細(xì)胞趨化性等方面。超高壓通過(guò)對(duì)阪崎腸桿菌的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體造成損傷,影響了細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力,破壞了細(xì)胞的正常新陳代謝能力,從而起到了殺菌的作用。