劉 彬，龍 軍，司良毅

401120 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心血管疾病中心

膿毒癥是一種由于宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的疾病，晚期常發(fā)生危及生命的多器官功能障礙[1-3]。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在膿毒癥治療上已取得長足的進(jìn)步，但膿毒癥每年仍會導(dǎo)致許多患者死亡[4]。膿毒性心臟功能損傷是膿毒癥最常見的并發(fā)癥，一旦出現(xiàn)心功能障礙，其病死率可達(dá)70%[5]。因此，探究膿毒性心功能障礙的相關(guān)機(jī)制及有效的治療策略，對治療膿毒癥有非常重要的意義。

SIRT1是一種保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的組蛋白去乙酰化酶，參與多種細(xì)胞內(nèi)信號，如衰老、凋亡、自噬和炎癥[6-7]。研究顯示SIRT1可通過抑制NF-κB的激活減少炎癥介質(zhì)的分泌，從而減輕炎癥反應(yīng)[8]。此外SIRT1對維持心肌細(xì)胞正常功能具有重要的作用[9]。既往研究表明，SIRT1在膿毒癥小鼠心肌中含量降低，而激活SIRT1則可改善膿毒癥引起的心功能障礙[10]。因此，SIRT1被認(rèn)為是治療膿毒性心功能障礙的靶點(diǎn)。

木犀草素(luteolin，LTN)是一種具有生物活性的類黃酮多酚化合物，可從許多蔬菜、水果和草本植物中分離出來[11]。LTN已被證明具有多種藥理作用，包括抗氧化、抗癌和抗炎等生物學(xué)特性[12]。LTN可通過改善心肌收縮功能和減少細(xì)胞凋亡來減少大鼠心臟缺血再灌注損傷[13]，也可通過發(fā)揮其抗炎作用減少脂毒性心肌損傷[14]。盡管越來越多的證據(jù)表明LTN具有心血管保護(hù)作用，但LTN對膿毒癥引起的心功能障礙是否具有保護(hù)作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(caecal ligation perforation, CLP)建立小鼠膿毒癥模型，探究LTN對膿毒性心臟損傷的作用及潛在機(jī)制，為臨床治療膿毒性心臟損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SIRT1抗體(WL02995)、p-p65抗體(WL02169)、p65抗體(WL01980)、β-actin抗體(WL01372)和山羊抗兔二抗(WLA023)均購自沈陽萬類生物科技有限公司。木犀草素(LTN，HY-N0162)購自美國MCE公司。LPS(S1732)、Mouse TNF-α ELISA Kit(PT512)、增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒(S0027)和DMSO(ST038-100 mL)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。MEM培養(yǎng)基(PM150410)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基(11965092)購自美國Gibco公司。胎牛血清(ST30-2602)購自德國PAN SERATECH公司。CCK-8試劑(B34304)購自上海畢傲圖生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞培養(yǎng)

42只體質(zhì)量約20 g的8周齡雄性C57BL/6小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于SPF級別的動物房中，溫度保持在20～22 ℃，光/暗12 h一循環(huán)，濕度保持在55%～60%，所有動物均可隨意獲取標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物食物和水。本實(shí)驗(yàn)全過程嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》。將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：Sham組、CLP組和CLP+LTN組，每組14只。小鼠心肌細(xì)胞HL-1和小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7購自武漢普諾賽生命科技有限公司。HL-1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。LTN溶于DMSO用于處理HL-1和RAW 264.7細(xì)胞，在非LTN處理的細(xì)胞中加入同等體積的DMSO，防止溶劑產(chǎn)生影響。使用培養(yǎng)RAW 267.4的培養(yǎng)基處理HL-1細(xì)胞：將RAW 264.7接種于培養(yǎng)皿，處理時(shí)先更換新鮮的培養(yǎng)基。使用1 μg/mL LPS伴或不伴LTN、siSIRT1處理RAW 264.7細(xì)胞，LPS使用濃度參考文獻(xiàn)[15]。待處理12 h后，收集培養(yǎng)基并離心吸取上清液用于ELISA檢測或者處理HL-1細(xì)胞24 h。

1.3 盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)

使用2%異氟烷將小鼠麻醉，并放置在37 ℃操作平臺上妥善固定，在左下腹做一約0.5 cm的切口。找到并取出盲腸，用4-0絲線在盲腸二分之一處結(jié)扎，再用21 g規(guī)格的針頭將盲腸末端刺穿。擠壓盲端確保穿孔處通暢，并還納盲腸入腹中。逐層縫合切口后，按5 mL/100 g的劑量皮下注射溫?zé)岬纳睇}水以促進(jìn)術(shù)后蘇醒。Sham組接受同樣的操作過程，但盲腸不結(jié)扎，不穿孔。用于動物實(shí)驗(yàn)的LTN溶于溶劑(10% DMSO、40%聚乙二醇、5%Tween-80、45%生理鹽水)。CLP+LTN組小鼠術(shù)前1 h通過腹腔注射0.2 mg/kg LTN，劑量依據(jù)文獻(xiàn)[16]，每12小時(shí)再次給予0.2 mg/kg LTN，其他非LTN注射組小鼠注射同等體積溶劑。術(shù)后24 h，完善心臟超聲檢測，斷頸法處死小鼠并取出心臟凍于液氮中備用。

1.4 生存實(shí)驗(yàn)

總共30只小鼠用于術(shù)后48 h小鼠生存觀察實(shí)驗(yàn)，每組10只。生存實(shí)驗(yàn)的小鼠不取材，不檢查心臟超聲，以防止任何多余操作對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。CLP+LTN組小鼠術(shù)前1 h予以0.2 mg/kg LTN腹腔注射，術(shù)后每12小時(shí)再次給予0.2 mg/kg LTN，除此之外無其他操作。期間小鼠可以自由獲取水和標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物食物。每12小時(shí)檢查小鼠存活情況。

1.5 心臟超聲

使用Vivid E95 (GE Healthcare)超聲儀進(jìn)行心臟超聲檢測，使用2%異氟烷將小鼠麻醉，保持心率在400～500 次/min區(qū)間且相互之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。心臟超聲檢測時(shí)，從乳頭肌水平的短軸視圖上獲得二維導(dǎo)向M型測量。測量的參數(shù)包括左室射血分?jǐn)?shù)和左室縮短系數(shù)。

1.6 Western blot檢測

用含1%PMSF和1%磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取小鼠心肌、RAW 264.7細(xì)胞和HL-1細(xì)胞中的蛋白。用BCA法測定蛋白濃度并用RIPA裂解液配平蛋白。加入上樣緩沖液后于100 ℃水浴鍋加熱10 min，得到可進(jìn)行Western blot檢測的樣品。使用10%的SDS-PAGE凝膠分離樣品蛋白并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST于室溫封閉膜1 h，再于4 ℃冰箱中孵育對應(yīng)抗體。次日取出膜于室溫中孵育二抗1.5 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)。

1.7 Real-time PCR檢測

采用Real-time PCR的方法檢測小鼠心肌組織和RAW 264.7細(xì)胞中的炎性因子mRNA表達(dá)水平。用RNA提取試劑盒提取總RNA，取1 μg提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用SYBR green對逆轉(zhuǎn)錄的18個(gè)cDNA進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。引物序列如下：TNF-α正義鏈 5′-GAGAAAGTCAACCTCCTCTCTG-3′，反義鏈 5′-GAA-GACTCCTCCCAGGTATATG-3′；IL-1正義鏈 5′-TTCAG-GCAGGCAGTATCACTC-3′，反義鏈 5′-GAAGGTCCAC-GGGAAAGACAC-3′；IL-6正義鏈 5′-GGAGCCCACCA-AGAACGATAGTCAA-3′，反義鏈 5′-TGTCACCAGCAT-CAGTCCCAAGAAGG-3′；β-actin正義鏈 5′-GCAAGCA-GGAGTACGATGAG-3′，反義鏈 5′-CCATGCCAATGTT-GTCTCTT-3′。

1.8 細(xì)胞活力

炎性損傷降低細(xì)胞活力，包括細(xì)胞數(shù)量和新陳代謝的降低[17-18]。采用CCK-8法對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，將細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板中。予以相應(yīng)處理后，棄去孔中液體，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基+10 μL CCK-8試劑，放入37℃敷箱孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的光密度值[D(450)]。

1.9 siRNA轉(zhuǎn)染

SIRT1 siRNA購自上海吉瑪基因。轉(zhuǎn)染時(shí)將SIRT1 siRNA+5 μL LipofectamineTM3000+250 μL Opti-MEM混勻，使SIRT1 siRNA終濃度為50 nmol/L。陰性對照組中將SIRT1 siRNA換成等量的NC。將轉(zhuǎn)染工作液加入培養(yǎng)皿中混勻。6 h后換新鮮的含10%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h再進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.10 ELISA檢測

使用TNF-α ELISA檢測試劑盒檢測RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α的含量，具體方法參考說明書。將樣品或標(biāo)準(zhǔn)品按每孔100 μL加入相應(yīng)的孔中，封板后室溫孵育2 h，洗板后每孔加入100 μL生物素化抗體室溫孵育1 h，再次洗板后每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin室溫避光孵育20 min。洗板后每孔加入100 μL顯色劑室溫避光孵育20 min。最后每孔加入50 μL終止液混勻，測量D(450)值。

1.11 ATP含量檢測

HL-1細(xì)胞內(nèi)ATP含量檢測使用增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒，具體方法參考說明書。HL-1細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，去培養(yǎng)基后，每孔加入200 μL裂解液充分裂解并吸入EP管，于4 ℃下12 000×g離心5 min，取上清液備用。取96孔板，每孔加入ATP檢測工作液100 μL，室溫放置5 min。每孔加入20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，后檢測化學(xué)發(fā)光。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LTN治療可提高膿毒癥小鼠生存率

對小鼠實(shí)施CLP手術(shù)建立膿毒癥模型，觀測Sham組、CLP組和CLP+LTN組48 h生存情況，并記錄死亡情況。結(jié)果顯示：CLP組12 h出現(xiàn)2例死亡，24 h死亡達(dá)到50%，48 h生存率為0，與Sham組相比，生存率顯著降低(P<0.05)。而CLP+LTN組的生存率得到改善，48 h生存率為50%，與CLP組相比，生存率顯著提高(P<0.05)，見圖1。提示LTN治療明顯提高CLP小鼠生存率。

A：LTN化學(xué)結(jié)構(gòu)；B：小鼠生存率(n=10) a: P<0.05，與Sham組比較; b: P<0.05，與CLP組比較

2.2 LTN治療減少膿毒癥導(dǎo)致的小鼠心功能障礙

CLP術(shù)后24 h，運(yùn)用超聲檢測Sham組、CLP組和CLP+LTN組小鼠心臟功能。與Sham組相比，CLP組小鼠左室射血分?jǐn)?shù)和左室縮短系數(shù)顯著下降(P<0.05)，而LTN治療可部分逆轉(zhuǎn)CLP對心臟功能的損傷(P<0.05)，見圖2。提示LTN治療可改善CLP小鼠心臟功能。

a: P<0.05，與Sham組比較; b: P<0.05，與CLP組比較

2.3 LTN治療防止膿毒癥引起的小鼠心肌SIRT1表達(dá)下降，并降低炎癥反應(yīng)

CLP術(shù)后24 h，取各組心臟進(jìn)行Western blot和PCR檢測。與Sham組相比，CLP組SIRT1表達(dá)明顯降低，p65磷酸化水平和TNF-α、IL-1、IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯提高(P<0.05)。而LTN治療可逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)(P<0.05)，見圖3。提示LTN治療可能通過SIRT1/NF-κB途徑降低膿毒癥小鼠心臟炎癥反應(yīng)。

a: P<0.05，與Sham組比較; b: P<0.05，與CLP組比較

2.4 LTN減少LPS處理下RAW 264.7細(xì)胞TNF-α分泌，提高RLM處理下HL-1細(xì)胞活力

使用1 μg/mL LPS處理RAW 264.7細(xì)胞12 h后，檢測培養(yǎng)基中TNF-α含量，結(jié)果見圖4A。LPS處理可顯著提高培養(yǎng)基中TNF-α的含量(P<0.05)，但可被LTN處理降低且呈濃度依賴(P<0.05)。收集RAW 264.7對照組培養(yǎng)基(RAW 264.7 Control Medium，RCM)和RLM處理HL-1心肌細(xì)胞24 h，并檢測細(xì)胞活力。RCM模擬正常環(huán)境，RLM模擬膿毒癥環(huán)境。在使用RLM處理的HL-1細(xì)胞中加入不同濃度的LTN，以判斷膿毒癥環(huán)境中LTN對心肌細(xì)胞活力的影響。與RCM處理相比，RLM可顯著降低HL-1細(xì)胞的活力(P<0.05)；但加入LTN處理后，細(xì)胞活力得到顯著改善，且呈濃度依賴性(P<0.05)，見圖4B。綜合上述結(jié)果，選取8 μmol/L 濃度的LTN用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

A：RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α含量檢測 a: P<0.05，與對照組比較; b: P<0.05，與LPS+0 μmol/L LTN組比較；B：HL-1細(xì)胞活力檢測 a: P<0.05，與RCM組比較; b: P<0.05，與RLM+0 μmol/L LTN組比較

2.5 siSIRT1敲低RAW 264.7細(xì)胞和HL-1細(xì)胞中SIRT1表達(dá)效率驗(yàn)證

為驗(yàn)證siSIRT1敲低效率，使用Western blot檢測Control組、NC組和siSIRT1組SIRT1表達(dá)。RAW 264.7細(xì)胞和HL-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示：與Control組相比，NC組SIRT1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與NC組相比，siSIRT1組可顯著降低SIRT1的表達(dá)(P<0.05)，見圖5。

2.6 LTN通過激活SIRT1抑制炎癥反應(yīng)

為探究LTN減輕炎癥是否通過SIRT1起作用，使用siRNA敲低RAW 264.7細(xì)胞SIRT1表達(dá)。與Control組相比，LPS可明顯降低SIRT1表達(dá)，提高p65磷酸化水平和TNF-α、IL-1、IL-6 mRNA表達(dá)(P<0.05)。LTN治療可以部分逆轉(zhuǎn)LPS的作用(P<0.05)。使用siSIRT1可使LTN的抗炎作用被抵消(P<0.05)。使用各個(gè)RAW 264.7細(xì)胞處理組的培養(yǎng)基處理HL-1細(xì)胞24 h，檢測HL-1細(xì)胞ATP含量和細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與RCM處理相比，RLM可顯著減低HL-1的ATP含量和細(xì)胞活力(P<0.05)，而使用RAW 264.7+LPS+LTN組的培養(yǎng)基(RLLM)處理的HL-1細(xì)胞的ATP含量和細(xì)胞活力較RLM組高(P<0.05)，使用RAW 264.7+LPS+LTN+siSIRT1組的培養(yǎng)基(RLLSM)處理的HL-1細(xì)胞的ATP含量和細(xì)胞活力則低于RLLM處理組(P<0.05)，見圖6。提示LTN通過改善SIRT1表達(dá)來降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減少心肌損傷。

1：Control組；2：LPS組；3：LPS+LTN組；4：LPS+LTN+siSIRT1組；A：Western blot檢測結(jié)果；B：SIRT1表達(dá)半定量分析；C：p65磷酸化水平半定量分析；D：TNF-α mRNA相對表達(dá)量；E：IL-1 mRNA相對表達(dá)量；F：IL-6 mRNA相對表達(dá)量 a: P<0.05，與Control組比較; b: P<0.05，與LPS組比較；c：P<0.05，與LPS+LTN組比較；G：HL-1細(xì)胞ATP含量；H：HL-1細(xì)胞活力 a: P<0.05，與RCM組比較; b: P<0.05，與RLM組比較；c：P<0.05，與RLLM組比較

2.7 LTN通過激活SIRT1增強(qiáng)心肌細(xì)胞對抗炎性損傷的能力

為進(jìn)一步探究LTN對心肌細(xì)胞自身對抗炎性損傷能力的影響，使用RCM、RLM、RLM+LTN和RLM+LTN+siSIRT1處理細(xì)胞，結(jié)果顯示，與RCM組相比，RLM顯著降低HL-1細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)、ATP含量和細(xì)胞活力(P<0.05)。而LTN處理可以逆轉(zhuǎn)上述作用(P<0.05)，但LTN的保護(hù)作用可被siSIRT1抵消(P<0.05)，見圖7。提示LTN可以通過激活SIRT1增強(qiáng)HL-1細(xì)胞自身對抗炎性損傷的能力，減少炎性損傷對功能和細(xì)胞活力的抑制。

1：RCM組；2：RLM組；3：RLM+LTN組；4：RLM+LTN+siSIRT1組；a: P<0.05，與RCM組比較; b: P<0.05，與RLM組比較；c：P<0.05，與RLM+LTN組比較

3 討論

膿毒癥是一種非常嚴(yán)重的全身性疾病，是重癥醫(yī)學(xué)中較常見、病死率較高的疾病之一[19-20]。其病情進(jìn)展快，常導(dǎo)致患者死亡[21]。本實(shí)驗(yàn)探究了LTN在膿毒性心肌損傷中的保護(hù)作用與相關(guān)機(jī)制。本研究首先發(fā)現(xiàn)LTN可以減少膿毒癥小鼠的死亡率，保護(hù)心功能，減少炎癥反應(yīng)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，敲低SIRT1表達(dá)可以抵消LTN在膿毒癥中帶來的抗炎和心肌細(xì)胞保護(hù)作用。本研究證明了LTN可以通過提高SIRT1表達(dá)來防止膿毒性心功能障礙。

本研究通過生存觀察實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CLP小鼠24 h死亡率可達(dá)到50%，而48 h CLP小鼠全部死亡。但LTN治療可明顯提高CLP小鼠的生存率，降低膿毒癥致死率。心功能障礙是膿毒癥最常見的并發(fā)癥，據(jù)報(bào)道，50%的膿毒癥患者表現(xiàn)出膿毒性心功能障礙，而膿毒性心功能障礙與死亡率增加有關(guān)[22]。由于心臟的泵功能減弱，無法泵出足夠多的血液參與血液循環(huán)，患者常常出現(xiàn)持續(xù)性的低血壓甚至休克[5]。已有研究指出保護(hù)心臟功能對治療膿毒癥具有重要意義[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)LTN治療可明顯提高CLP小鼠的左室射血分?jǐn)?shù)和左室縮短系數(shù)，表明在LTN治療的膿毒癥小鼠中，心臟泵功能得到改善。

研究表明SIRT1對心臟功能具有重要保護(hù)作用，是心功能障礙的重要治療靶點(diǎn)[25-26]。近期有研究顯示，提高SIRT1可以保護(hù)LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠心臟功能[27]。本研究結(jié)果顯示，LTN治療可以提高膿毒癥小鼠心臟SIRT1表達(dá)，提示SIRT1或許在LTN抗膿毒性心肌損傷中具有重要的作用。

過度的炎癥反應(yīng)是造成膿毒性心肌損傷最為重要的原因之一，許多研究表明抑制炎癥反應(yīng)可以減少膿毒性心功能損傷[28-29]。NF-κB是一條非常經(jīng)典的炎癥反應(yīng)通路，SIRT1被證實(shí)可通過抑制NF-κB減少炎癥反應(yīng)[30-31]。p65是NF-κB最重要的亞基。當(dāng)p65發(fā)生磷酸化時(shí)，NF-κB轉(zhuǎn)位入核進(jìn)而啟動炎癥因子轉(zhuǎn)錄，如TNF-α、IL-1、IL-6等[32]。本研究發(fā)現(xiàn)LTN治療的膿毒癥小鼠心臟中p65磷酸化水平受到抑制，炎性因子的轉(zhuǎn)錄也減少。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)LTN可以減少LPS引起的TNF-α分泌、NF-κB激活和相關(guān)炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄，而敲低SIRT1可以逆轉(zhuǎn)LTN的抗炎作用。ATP是細(xì)胞的直接供能物質(zhì)，心肌細(xì)胞需要消耗大量ATP來完成收縮舒張等生理功能，若ATP含量下降可以導(dǎo)致細(xì)胞功能下降[33-34]。本研究使用不同RAW 264.7細(xì)胞處理組的培養(yǎng)基刺激HL-1細(xì)胞，結(jié)果表明使用RLLM處理的HL-1細(xì)胞較RLM處理組有更高的ATP含量和細(xì)胞活力，這可能得益于LTN處理RAW 264.7細(xì)胞后減少了LPS引起的炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明LTN治療通過激活SIRT1來減少炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞，提高心臟功能。

為了探究LTN治療對提高心肌細(xì)胞自身抗炎性損傷的作用，以及SIRT1在其中的角色，本研究使用小鼠心肌細(xì)胞系HL-1進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示LTN可以通過激活SIRT1來減少RLM處理引起的HL-1細(xì)胞ATP含量和細(xì)胞活力下降。這些結(jié)果表明LTN激活SIRT1不僅可以通過減輕炎癥反應(yīng)來保護(hù)心臟功能，還可通過提高心肌細(xì)胞自身對抗炎性損傷的能力來減少膿毒癥引起的心功能障礙。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LTN治療可以通過激活SIRT1來抑制NF-κB相關(guān)的炎癥反應(yīng)，并提高心肌細(xì)胞自身抗炎性損傷的能力，從而減少心功能障礙，改善膿毒癥小鼠生存率，為臨床治療膿毒性心肌損傷提供了新的思路。