張貴明,倪向敏,崔涵強,徐 喆,李 碩,王 建

400037 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第二附屬醫(yī)院營養(yǎng)科

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)以肝細胞中過量的甘油三酯(triglyceride，TG)積累為特征,可從單純性脂肪變性發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化、肝硬化，甚至肝細胞癌，影響著全球大約25%的人口，已成為一個日益嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路的持續(xù)激活可促進腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥因子的釋放，引起慢性炎癥狀態(tài)和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，進而促進NAFLD的發(fā)展。NF-κB及其下游信號通路受雌激素信號通路的抑制，因而雌激素缺乏會增加機體的炎癥因子水平[2]。絕經后女性由于雌激素水平降低,導致其NAFLD發(fā)病率遠高于絕經前婦女,激素替代療法(hormone replacement therapy, HRT)可有效改善絕經后NAFLD的肝臟炎癥和脂肪變性，但可能增加乳腺癌發(fā)生風險限制了其臨床應用[3]。

大豆異黃酮(soy isoflavones，SIF)是一種天然的植物化合物,其分子結構和生物活性與體內合成的雌激素相似，在豆類植物中含量較為豐富，具有抗炎、抗氧化、改善IR、緩解脂質代謝紊亂等多種生物學效應，SIF作為植物雌激素并沒有合成雌激素的副作用[4-7]。人群調查研究發(fā)現(xiàn)，膳食SIF攝入水平與NAFLD發(fā)病率呈負相關[8-9]。SIF的生物學效應與其腸道代謝產物雌馬酚(equol，Eq)密切相關，Eq比其前體更穩(wěn)定，清除率更低，具有更高的雌激素活性，表現(xiàn)出很強的抗炎、抗氧化作用，在緩解女性更年期癥狀，以及預防心血管疾病、骨質疏松、慢性腎病、惡性腫瘤等方面顯示出良好的效果[10]。然而,目前國內外關于Eq干預對絕經后NAFLD的作用研究甚少。本研究通過高脂飲食(high-fat diet，HFD)喂養(yǎng)去卵巢大鼠建立絕經后NAFLD模型,觀察Eq干預對絕經后NAFLD的影響,并探討其中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

Eq購自上海大賽璐藥物手性技術有限公司，17β-雌二醇(estradiol，E2)、游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-c)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-c)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase，ALT)，天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒廠家為南京建成生物工程研究所。TNF-α、IL-6、雌激素和胰島素檢測ELISA試劑盒購自廈門惠佳生物科技有限公司?？俁NA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒、引物、GAPDH一抗、過氧化物酶偶聯(lián)的二抗購自上海生工生物技術有限公司。RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技。NF-κB p-p65 一抗購自上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司。大鼠高脂飼料購自北京華富康生物科技公司。

1.2 實驗及分組

實驗按照陸軍軍醫(yī)大學動物保護與使用委員會批準的程序進行。5周齡雌性SD大鼠60只，購自北京華富康生物科技公司。將大鼠置于溫度[(21±2)℃]和濕度[(50±10)%]條件下，標準光照(12 h光/暗)循環(huán)，自由攝入標準飲食和水。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉400 mg/kg麻醉，進行假手術或卵巢切除(ovariectomized,OVX)。7 d后選取10只假手術大鼠作為假手術組,喂普通飼料；50只OVX大鼠按隨機數(shù)字表法分為：OVX+HFD組，OVX+HFD+低、中、高劑量[20、40、80 mg/(kg·d)] Eq干預組，OVX+HFD+E2[0.25 mg/(kg·d)]干預組,每組10只,喂高脂飼料。Eq和E2以灌胃方式給藥,其余組給予等量生理鹽水,每日1次,連續(xù)12周。12周后大鼠存活51只(死亡原因均為灌胃后窒息所致)，大鼠禁食12 h，麻醉后稱量、采血，處死、取肝組織樣品。

1.3 大鼠肝臟組織形態(tài)學觀察

所有大鼠取肝臟相同部位，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，常規(guī)切片5 μm厚，HE染色后使用奧林巴斯顯微鏡觀察肝臟組織形態(tài)學變化，以超過5%的肝細胞出現(xiàn)大泡性脂肪變性作為NAFLD的病理診斷標準[11]。

1.4 稱量大鼠肝臟濕質量,計算肝指數(shù)

處死大鼠后迅速去除肝臟周圍組織,稱量肝臟濕質量并計算肝指數(shù)(肝臟濕質量/體質量×100%)。

1.5 血清雌激素、FPG、FINS水平及HOMA-IR檢測

血液樣本4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集血清，采用全自動臨床化學分析儀測定空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)水平。ELISA試劑盒檢測血清雌激素、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-IR, HOMA-IR)，HOMA-IR=FPG×FINS÷22.6。

1.6 血清和肝臟脂質水平檢測

按照試劑盒說明書檢測血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA水平；肝臟勻漿于生理鹽水中，采用試劑盒測定勻漿中TG、TC水平。

1.7 肝損傷血清生化指標檢測

按照試劑盒說明書檢測血清ALT、AST水平。

1.8 血清和肝臟炎癥因子水平檢測

按照試劑盒說明書檢測血清TNF-α、IL-6水平；肝臟勻漿于生理鹽水中，采用試劑盒測定勻漿中TNF-α、IL-6水平。

1.9 實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

按照試劑盒的說明，用TRIzol試劑提取肝組織總RNA。測定RNA濃度，用逆轉錄酶試劑盒將RNA轉錄為cDNA。利用NCBI網站設計大鼠TNF-α、IL-6和GAPDH序列特異性引物,見表1。Bio-Rad PCR儀進行qRT-PCR,采用比較周期閾值(Ct) (2-ΔΔCt)方法定量RNA的相對量。

表1 引物序列

1.10 Western blot檢測

肝組織用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液勻漿，在10 000×g轉速下4 ℃離心10 min。按試劑盒說明測定上清液中的蛋白濃度后采用Western blot檢測肝組織等量蛋白中NF-κB p-p65、GAPDH的表達情況，顯影后用Image J軟件計算灰度值進行統(tǒng)計分析。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Eq對大鼠肝臟組織學改變的影響

肝組織 HE 染色可見:假手術組大鼠肝細胞結構及排列正常;OVX+HFD組大鼠肝細胞結構及排列紊亂,匯管區(qū)出現(xiàn)炎癥細胞浸潤,出現(xiàn)大量脂滴空泡,符合NAFLD的診斷標準；經Eq或E2干預后，肝細胞結構及排列紊亂有所改善，炎癥細胞浸潤和脂滴空泡減少,且隨著Eq干預劑量增加，其對脂肪肝病理變化的改善效應有增強趨勢，見圖1。

2.2 Eq對大鼠體質量、肝臟濕質量、肝指數(shù)的影響

與假手術組比較，OVX+HFD組大鼠體質量、肝臟濕質量及肝指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與OVX+HFD組比較，Eq干預后大鼠肝臟濕質量及肝指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，其中Eq中、高劑量組顯著降低大鼠體質量(P<0.05)，與E2具有相似的作用效果，干預效應隨Eq劑量增加而增強，見圖2。

1:假手術組(n=10); 2:OVX+HFD組(n=8); 3:OVX+HFD+低劑量Eq干預組(n=8); 4:OVX+HFD+中劑量Eq干預組(n=8); 5:OVX+HFD+高劑量Eq干預組(n=8); 6:OVX+HFD+E2干預組(n=9)；a:P<0.05，與假手術組比較;b:P<0.05，與OVX+HFD組比較

2.3 Eq對大鼠血清雌激素、FPG、FINS水平及HOMA-IR的影響

與假手術組比較，OVX+HFD 組大鼠血清雌激素水平顯著下降(P<0.05),血清FPG、FINS水平，HOMA-IR顯著升高(P<0.05)；與OVX+HFD組比較，經Eq或E2干預后，大鼠血清雌激素水平顯著升高(P<0.05),血清FPG、FINS水平，HOMA-IR顯著降低(P<0.05)，Eq干預效果呈現(xiàn)一定劑量依賴效應，見圖3。

1:假手術組(n=10); 2:OVX+HFD組(n=8); 3:OVX+HFD+低劑量Eq干預組(n=8); 4:OVX+HFD+中劑量Eq干預組(n=8); 5:OVX+HFD+高劑量Eq干預組(n=8); 6:OVX+HFD+E2干預組(n=9)；a:P<0.05，與假手術組比較;b:P<0.05，與OVX+HFD組比較

2.4 Eq對大鼠血清脂質水平的影響

與假手術組比較，OVX+HFD組大鼠血清HDL-c水平顯著降低(P<0.05)，血清TG、TC、LDL-c、FFA水平顯著升高(P<0.05)；Eq干預后，OVX+HFD大鼠血清TG、TC、LDL-c、FFA水平顯著降低(p<0.05)，血清HDL-c水平顯著升高(P<0.05)，與E2具有相似的作用效果，隨著干預劑量增加,Eq的效應更加明顯,見圖4。

1:假手術組(n=10); 2:OVX+HFD組(n=8); 3:OVX+HFD+低劑量Eq干預組(n=8); 4:OVX+HFD+中劑量Eq干預組(n=8); 5:OVX+HFD+高劑量Eq干預組(n=8); 6:OVX+HFD+E2干預組(n=9)；a:P<0.05，與假手術組比較;b:P<0.05，與OVX+HFD 組比較

2.5 Eq對大鼠肝臟脂質水平的影響

與假手術組比較，OVX+HFD組大鼠肝臟TG、TC水平顯著升高(P<0.05)，與OVX+HFD組比較,Eq干預后OVX+HFD大鼠肝臟TG、TC水平顯著降低(P<0.05)，與E2具有相似的作用效果,Eq干預效果呈現(xiàn)一定劑量依賴效應，見圖5。

1:假手術組(n=10); 2:OVX+HFD組(n=8); 3:OVX+HFD+低劑量Eq干預組(n=8); 4:OVX+HFD+中劑量Eq干預組(n=8); 5:OVX+HFD+高劑量Eq干預組(n=8); 6:OVX+HFD+E2干預組(n=9)；a:P<0.05，與假手術組比較;b:P<0.05，與OVX+HFD組比較

2.6 Eq對大鼠ALT和AST水平的影響

與假手術組比較，OVX+HFD組大鼠血清ALT、AST水平顯著升高(P<0.05)，與OVX+HFD組比較，Eq或E2干預后大鼠血清ALT、AST水平顯著降低(P<0.05)，Eq干預效果呈現(xiàn)一定劑量依賴效應，見圖6。

2.7 Eq對大鼠血清和肝臟炎癥因子水平的影響

與假手術組比較，OVX+HFD組大鼠血清和肝臟炎癥因子TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)，與OVX+HFD組比較，Eq干預后大鼠血清和肝臟TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.05)，與E2具有相似的作用效果，隨著干預劑量增加，Eq的效應增強，見圖7。

1:假手術組(n=10); 2:OVX+HFD組(n=8); 3:OVX+HFD+低劑量Eq干預組(n=8); 4:OVX+HFD+中劑量Eq干預組(n=8); 5:OVX+HFD+高劑量Eq干預組(n=8); 6:OVX+HFD+E2干預組(n=9)；a:P<0.05，與假手術組比較;b:P<0.05，與OVX+HFD組比較

2.8 Eq對大鼠肝臟TNF-α、IL-6 mRNA表達的影響

與假手術組比較，OVX+HFD組肝組織炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05)；Eq或E2干預后肝組織TNF-α、IL-6 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖8。

1:假手術組(n=10); 2:OVX+HFD組(n=8); 3:OVX+HFD+低劑量Eq干預組(n=8); 4:OVX+HFD+中劑量Eq干預組(n=8); 5:OVX+HFD+高劑量Eq干預組(n=8); 6:OVX+HFD+E2干預組(n=9)；a:P<0.05，與假手術組比較;b:P<0.05，與OVX+HFD 組比較

2.9 Eq對大鼠肝臟NF-κB p-p65蛋白表達的影響

與假手術組比較，OVX+HFD組肝組織NF-κB p-p65蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；Eq干預后肝組織TNF-κB p-p65蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖9。

1:假手術組(n=10); 2:OVX+HFD組(n=8); 3:OVX+HFD+低劑量Eq干預組(n=8); 4:OVX+HFD+中劑量Eq干預組(n=8); 5:OVX+HFD+高劑量Eq干預組(n=8); 6:OVX+HFD+E2干預組(n=9)

3 討論

NAFLD發(fā)病機制復雜,“多重打擊”假說認為胰島素抵抗(IR)、脂質過氧化、炎癥因子、腸道微環(huán)境等多種因素作用于易感個體，共同促進NAFLD的發(fā)生、發(fā)展[12]。NF-κB是一種參與先天和適應性免疫反應的轉錄因子,在肝臟炎癥信號通路的調節(jié)中發(fā)揮重要作用,在NAFLD動物模型和NASH患者中顯示了持續(xù)的NF-κB通路激活[2,12]。正常情況下，NF-κB通過與抑制蛋白結合被隔離在細胞質中，在低雌激素、高脂等條件下,NF-κB抑制蛋白磷酸化降解允許NF-κB轉移到細胞核,誘導編碼TNF-α和IL-6等炎癥因子的靶基因表達,引起炎癥反應和肝損傷[13]。雌激素是女性最重要的激素,絕經前主要由卵巢合成,絕經后由于卵巢功能減退導致其濃度急劇降低[14],NF-κB及其下游信號通路受雌激素信號通路的抑制,這一調控作用解釋了與絕經相關的肝臟炎癥的過度調節(jié),并導致NAFLD向更有害的NASH、纖維化和肝癌等情況發(fā)展[2]。

飲食和生活方式的改變以及壽命的延長使絕經后婦女NAFLD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。NAFLD與心血管疾病、骨質疏松、惡性腫瘤、各種內分泌疾病緊密相關,這種疾病的日益流行及其可能造成的嚴重并發(fā)癥給患者帶來巨大的經濟負擔和較差的生活質量[1]。然而,目前針對NAFLD的治療并不理想,缺乏有效的藥物治療手段。盡管有研究顯示，接受激素替代療法(HRT)可降低絕經后婦女NAFLD患病風險,但婦女健康倡議的評估結果認為HRT的總體風險超過了它的益處,不推薦把HRT作為一種長期治療手段[15-16]。因此探索一種安全有效、易于長期堅持的治療方法很有意義。近年來，植物雌激素在脂肪肝治療中的作用開始受到密切關注，本研究通過切除大鼠卵巢加高脂飲食誘導NAFLD模型,模擬絕經后婦女NAFLD病變,探討Eq對NAFLD大鼠的作用、炎癥因子的表達的影響及可能的機制。

NF-κB活化伴有NF-κB p65蛋白磷酸化的增多,p65蛋白磷酸化可作為NF-κB通路激活的標志[17]。TNF-α在與肝損傷相關的細胞因子網絡中具有關鍵作用,一方面TNF-α表達受NF-κB信號的調控,另一方面TNF-α可通過磷酸化NF-κB抑制因子來激活NF-κB,進一步促進TNF-α轉錄,形成了一個炎癥性的正反饋回路[18]。TNF-α和IL-6是機體的重要炎癥細胞因子,一方面可以促進機體炎癥的發(fā)生,另一方面可通過抑制胰島素受體底物磷酸化,損害胰島素信號誘發(fā)IR[19]。IR是NAFLD的一個主要特征,對脂肪毒性、氧化應激和炎癥級聯(lián)激活的建立至關重要[12]。在IR狀態(tài)下,肝胰島素不能抑制肝臟葡萄糖生成但能促進脂質合成,導致高血糖、高甘油三酯血癥和肝臟脂肪變性[20]。此外,胰島素具有抑制脂肪組織脂解的作用，在IR狀態(tài)下,這種抑制受損,導致FFA向肝臟的外排增加,肝細胞中的FFA一方面通過絲氨酸激酶的激活來誘導胰島素信號通路的缺陷,另一方面FFA增多會導致脂質的異常堆積,促進TNF-α、IL-6等炎癥介質的增多,造成炎癥、IR的惡性循環(huán),加速NAFLD的進展[12,19]。從單純性肝脂肪變性到NASH或從NASH到肝硬化的分子機制尚不完全清楚,但肝組織炎癥細胞聚集和IR是其中的關鍵步驟[21]。

本研究干預結束時,與假手術組比較,OVX+HFD大鼠雌激素水平顯著降低,肝臟組織學檢查可見大面積的脂肪變性,成功誘導低雌激素高脂飲食環(huán)境下的NAFLD。OVX+HFD大鼠血清HDL-c水平降低, 血清TG、TC、LDL-c、FFA和肝臟TG、TC水平升高,出現(xiàn)高脂血癥、肝臟脂質異常沉積等脂質代謝紊亂;血清和肝臟TNF-α、IL-6水平增高,出現(xiàn)明顯的炎癥反應；同時FPG、FINS和HOMA-IR升高。AST和ALT是反應肝功能常用指標,在出現(xiàn)肝損傷和炎癥等條件下,AST和ALT的水平會顯著升高[22],本研究中OVX+HFD大鼠血清AST和ALT水平較假手術組顯著升高,說明大鼠出現(xiàn)了明顯的肝功能的異常。通過qRT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)肝組織TNF-α、IL-6 mRNA及NF-κB p-p65蛋白表達水平增高。研究顯示,Eq可通過抗炎作用發(fā)揮生物學效應[23-25],SUBEDI等[23]發(fā)現(xiàn)Eq可有效抑制NF-κB活性,降低TNF-α、IL-6等炎癥因子表達,保護小膠質細胞介導的神經炎癥損傷。LU等[24]的研究也發(fā)現(xiàn),Eq可通過抑制NF-κB活性,減少TNF-α、IL-6的表達減輕神經炎癥反應,有效改善小鼠全身注射脂多糖引起的抑郁樣行為。BANDARA等[25]發(fā)現(xiàn)，Eq可以劑量依賴性降低TNF-α、IL-6的表達，減輕大鼠皮膚炎癥。本研究顯示,Eq干預后大鼠血清雌激素維持在更高水平,有效減輕了OVX+HFD大鼠體質量、肝指數(shù)、HOMA-IR、炎癥反應水平和肝臟脂肪病變程度，改善了大鼠肝功能和脂質代謝紊亂，下調了肝組織TNF-α和IL-6 mRNA和NF-κB p-p65蛋白水平,隨著干預劑量增加,Eq的效應更加明顯,與E2具有相似的作用效果。

綜上所述，Eq能有效改善高脂飲食去卵巢誘導的大鼠非酒精性脂肪肝,其部分機制可能是Eq通過抑制NF-κB信號，減少炎癥因子TNF-α、IL-6表達,減輕大鼠炎癥和IR水平,最終有效減輕了大鼠脂質代謝紊亂和肝功能的異常。本研究為揭示Eq臨床防治絕經后婦女NAFLD提供了新的科學依據(jù)，但Eq調控NF-κB信號通路的具體機制尚需進一步深入研究。值得注意的是,由于飲食習慣和腸道微環(huán)境的差異,并不是所有人都能代謝SIF產生Eq而從中獲益[26],而經常性食用含SIF食物可以提高腸道中代謝SIF產生Eq菌群的豐度,使非Eq產生者向Eq產生者轉變[10],因此,對于有發(fā)展成為NAFLD傾向的絕經后女性,如沒有特殊禁忌,可適當增加飲食中富含SIF食物而從中獲益。