周艷紅，周明明，李愛華

400030 重慶，重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院：醫(yī)?？?，重癥醫(yī)學(xué)科2，消化內(nèi)科3

感染性休克是一種由宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的多器官系統(tǒng)功能障礙疾病[1]。急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是感染性休克早期最常見的合并疾病[2]。AKI發(fā)生在51%的感染性休克患者中，導(dǎo)致死亡率增加高達(dá)41%[3]。更重要的是，嚴(yán)重AKI構(gòu)成了中度殘疾事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并進(jìn)一步與感染性休克幸存者的功能結(jié)局較差相關(guān)[4]。盡管目前針對(duì)感染性休克合并AKI的治療有了更多的了解，但AKI的診斷標(biāo)準(zhǔn)仍然基于血清肌酐(serum creatinine，Scr)水平的升高或尿量的減少[2]。然而，Scr缺乏敏感性和特異性，并且與尿量水平相關(guān)的準(zhǔn)確性較低。此外，感染性休克合并AKI的病理生理學(xué)不僅涉及促炎和抗炎反應(yīng)的早期激活，還涉及代謝紊亂[5]。因此，使用當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)診斷感染性AKI是不夠的。進(jìn)一步了解感染性休克合并AKI的早期代謝改變具有重要的臨床意義。代謝組學(xué)研究調(diào)查細(xì)胞和有機(jī)體代謝的狀態(tài)，提供宿主疾病的實(shí)時(shí)代謝分析[6]。這種分析允許識(shí)別生物流體(例如尿液和血液)中生物標(biāo)志物變化的模式。本研究對(duì)患者尿液進(jìn)行了非靶向代謝分析，并比較了重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)中患有和未患有AKI的感染性休克患者的差異。本研究的目的是利用代謝組學(xué)方法來識(shí)別感染性休克患者AKI的生物標(biāo)志物，這可能有助于診斷和識(shí)別相關(guān)代謝途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究招募了2020年3月至2022年3月本院ICU收治且診斷為感染性休克的所有符合條件的患者。感染性休克的定義根據(jù)第三個(gè)國(guó)際共識(shí)定義(Sepsis-3)[7]。膿毒癥被確定為感染后序貫器官衰竭評(píng)估評(píng)分≥2分的急性變化。當(dāng)持續(xù)性低血壓患者需要血管升壓藥以維持平均動(dòng)脈壓≥65 mmHg，并且即使進(jìn)行了足夠的容量復(fù)蘇后，血清乳酸水平>2 mmol/L，則診斷為感染性休克。AKI的診斷基于改善全球腎臟病預(yù)后組織(KDIGO)標(biāo)準(zhǔn)[3]，定義為48 h內(nèi)Scr增加≥26.5 mol/L，或Scr增加超過基線水平的1.5倍，或6 h內(nèi)尿量<0.5 mL/(kg·h)。納入標(biāo)準(zhǔn)包括年齡≥18歲、在ICU住院至少24 h、臨床資料完整的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①研究開始時(shí)已使用腎臟替代療法；②有腎移植史；③在ICU多日的繼發(fā)感染患者；④懷孕和哺乳期的婦女；⑤在進(jìn)入ICU前至少1周接觸過放射性造影劑或腎毒性藥物；⑥急性心腦血管事件、惡性腫瘤、嚴(yán)重血液病患者；⑦其他導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少的合并癥，如惡性腫瘤、營(yíng)養(yǎng)不良、HIV感染、自身免疫性疾病、免疫抑制劑、細(xì)胞毒劑等。從所有患者或其近親處獲得參與研究的書面知情同意書。本研究經(jīng)過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020-062)。

1.2 樣品采集和制備

根據(jù)進(jìn)入ICU后48 h內(nèi)是否發(fā)生AKI將感染性休克患者分為有AKI(AKI組)和無AKI(NAKI組)。為了檢查不同代謝物的動(dòng)態(tài)變化，在感染性休克診斷后12 h和24 h收集尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析。從患者導(dǎo)尿管中抽取5～6 mL尿液。在采集過程中采取嚴(yán)格的無菌技術(shù)，通過兩種方法留取標(biāo)本：一種是嚴(yán)格外陰消毒以后留取的中段尿標(biāo)本，另一種是留置導(dǎo)尿管以后留取的中段尿標(biāo)本。然后立即在4 ℃下以2 000 r/min的速度將整個(gè)樣本離心20 min。收集上清液并添加疊氮化鈉至1/100(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。然后將混合物以每管1 mL分配，并儲(chǔ)存在-80 ℃的冰箱中以供分析。對(duì)于測(cè)定，尿液樣本在4 ℃下解凍，每個(gè)樣本取100 μL與400 μL冷甲醇/乙腈(1∶1，體積分?jǐn)?shù))混合，渦旋60 s，然后置于20 ℃ 1 h，以去除蛋白質(zhì)。隨后將樣品在4 ℃下以14 000 r/min離心20 min，將上清液冷凍干燥并在-80 ℃下保存。為了檢查該分析平臺(tái)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，通過從每個(gè)樣品中匯集10 μL來制備質(zhì)量控制樣品。

1.3 超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

使用Agilent 1290 Infinity UPLC親水相互作用色譜(HILIC)，在25 ℃下以0.3 mL/min的流速分離樣品。流動(dòng)相A和B分別是0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫條件如下：0～1 min，95%流動(dòng)相B；1～14 min，流動(dòng)相B從95%線性變化到65%； 14～16 min，流動(dòng)相B從65%線性變化到40%；16～18 min，流動(dòng)相B為40%；18 ～18.1 min，流動(dòng)相B從40%線性變化到95%；18.1～23 min，流動(dòng)相B為95%。在整個(gè)過程中將樣品保存在4 ℃的自動(dòng)進(jìn)樣器中。在連續(xù)分析過程中使用隨機(jī)序列以避免儀器信號(hào)波動(dòng)的干擾。使用電噴霧電離(ESI)的正離子和負(fù)離子模式來檢測(cè)信號(hào)。使用UPLC分離收集樣品的成分，并使用Triple TOF 5600質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)分析數(shù)據(jù)。HILIC色譜分離后ESI的源條件如下：離子源氣體1，60 psi；離子源氣體2，60 psi；氣簾，30 psi；源溫度，600 ℃；離子噴霧電壓浮動(dòng)，5 000 V(+)和-5 000 V(-)。TOF MS掃描m/z范圍為60～1 000 Da，子離子掃描m/z范圍為25～1 000 Da，TOF MS掃描累積時(shí)間為0.2 s/譜，子離子掃描累積時(shí)間為0.05 s/譜。檢出限按信噪比3/1計(jì)算。使用信息相關(guān)采集(IDA)來檢測(cè)和識(shí)別MS/MS光譜，并使用高靈敏度模型，其去簇電位為60 V(+)和-60 V(-)，碰撞能量為(35±15)eV。

1.4 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析

使用ProteoWizard將原始超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF/MS)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式，然后使用XCMS進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和峰面積提取程序。使用MaxQuant-Andromeda軟件套件(版本1.6.3.4)和大多數(shù)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和定量。從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)下載的人標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(17 038個(gè)序列；僅審查；2020年3月版)用于數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。對(duì)于全局蛋白質(zhì)組分析，應(yīng)用以下參數(shù)：前體和片段的質(zhì)量公差分別為10×106和20×106；肽長(zhǎng)度至少為7個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)和肽的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)設(shè)定為1%。對(duì)于全局蛋白質(zhì)組定量，首先過濾MaxQuant輸出結(jié)果(proteinGroups.txt)以排除那些“僅由站點(diǎn)識(shí)別”、“潛在污染物”和“反向命中”，然后進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換。在Perseus環(huán)境中使用默認(rèn)參數(shù)(版本1.6.1.3)執(zhí)行下游數(shù)據(jù)分析，例如缺失值插補(bǔ)、層次聚類、主成分分析(PCA)、t檢驗(yàn)、相關(guān)性和火山圖。使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)進(jìn)行基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG) 通路分析。對(duì)于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析，StringApp用于Cytoscape環(huán)境(版本3.8.0)。交互得分設(shè)置為0.9，即最高置信度截止值，以檢索潛在的交互。在此過程中啟用“加載豐富數(shù)據(jù)”選項(xiàng)以檢索STRING網(wǎng)絡(luò)的功能豐富(最小顯著性閾值FDR為0.05)。

1.5 ELISA實(shí)驗(yàn)

按ELISA試劑盒[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，加入抗體、顯色劑、終止液，得到吸光度值，并以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算尿液樣品中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL)、幾丁質(zhì)酶樣蛋白3(chitinase-like protein 3，Chil3)、S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8，S100A8)和銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin，CP)含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 參與者的臨床特征

在100名患者中，42例感染性休克合并AKI(AKI組)，58例沒有AKI(NAKI組)。在感染性休克診斷后12 h，兩組患者均收集尿液樣本(分別為AKI1和NAKI1)；而感染性休克診斷后24 h，AKI和NAKI組中分別收集32例和48例患者尿液樣本(分別為AKI2和NAKI2)。由于兩組在12 h和24 h收集的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)特征相似，因此在24 h時(shí)兩組減少10例患者進(jìn)行分析。入組患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征見表1。與NAKI組相比，AKI組患者入組時(shí)SCr、乳酸和全因死亡率顯著增加(P<0.05)，eGFR顯著降低(P<0.001)。

表1 感染性休克患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和特征

2.2 感染性休克合并AKI的代謝組學(xué)分析

為了表征感染性休克合并AKI的分子變化，對(duì)患者的尿液進(jìn)行定量無標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并鑒定了超過3 500種蛋白質(zhì)。使用歐幾里得距離的層次聚類，發(fā)現(xiàn)NAKI和AKI腎臟之間有明顯的分離(圖1A)。在主成分分析中，NAKI和AKI樣本可以清楚地區(qū)分。相比之下，NAKI1和NAKI2腎的蛋白質(zhì)組學(xué)特征相似(圖1B)。基因本體術(shù)語(yǔ)富集分析顯示，AKI患者中與細(xì)胞外基質(zhì)和急性期反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)在感染性休克診斷后增加，與影響組織中炎癥、纖維化反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)機(jī)制一致；相反，與離子、氨基酸和代謝物排泄相關(guān)的蛋白質(zhì)以及與線粒體相關(guān)的蛋白質(zhì)減少(圖1C)。

A：熱圖 示兩組尿液中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的表達(dá)模式；LFQ：非標(biāo)記定量強(qiáng)度；B：主成分分析 NAKI組和AKI組尿液中的蛋白質(zhì)組學(xué)特征；C、D：NAKI組和AKI組尿液中蛋白質(zhì)增加和減少的基因本體術(shù)語(yǔ)富集分析(Fisher精確檢驗(yàn)，F(xiàn)DR=0.02)

2.3 比較聚類分析識(shí)別與AKI損傷程度相關(guān)的全局蛋白質(zhì)組模式

進(jìn)行層次聚類分析，將全局蛋白質(zhì)組學(xué)變化定義為6個(gè)主要簇，每個(gè)簇具有超過10種蛋白質(zhì)。3個(gè)簇(簇1、2、3)的蛋白質(zhì)模式隨著損傷程度的增加而增加(蛋白質(zhì)表達(dá)NAKI1< NAKI2

A：層次聚類分析 將全局蛋白質(zhì)組學(xué)變化定義為6個(gè)主要簇；B：每個(gè)聚類中的基因本體術(shù)語(yǔ)富集分析(Fisher精確檢驗(yàn)，F(xiàn)DR<0.02) 1～6：分別表示簇1～簇6；C：使用Cytoscape軟件中的String App對(duì)72種已識(shí)別的SLC蛋白構(gòu)建蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和功能富集簇 淺藍(lán)色為非差異(FC<1.5)蛋白質(zhì)；青色為顯著差異的蛋白質(zhì)；粉紅色和紅色為差異磷蛋白；基于富集數(shù)據(jù)(Cytoscape中的嵌入功能)對(duì)蛋白質(zhì)簇進(jìn)行注釋，4組中代表性SLC蛋白譜，紅線為磷酸鹽強(qiáng)度，黑色為未修飾形式；D：熱圖 示ANOVA顯著差異(P<0.05)的蛋白質(zhì)和磷酸位點(diǎn)

2.4 感染性休克合并AKI的早期生物學(xué)標(biāo)志物

檢查與感染性休克合并AKI的早期相關(guān)的特征蛋白。分別在第12小時(shí)或第24小時(shí)對(duì)感染性休克合并AKI和感染性休克NAKI進(jìn)行了成對(duì)比較，以突出顯著的標(biāo)記蛋白(圖3A、B)。在這些數(shù)據(jù)中，與感染性休克NAKI患者相比，感染性休克合并AKI患者的NGAL、Chil3、S100A8和CP均顯著增加(P<0.05，圖3C～F)。此外，通過ELISA法驗(yàn)證了感染性休克合并AKI患者的NGAL、Chil3、S100A8和CP顯著高于NAKI(P<0.05，表2)。相關(guān)性分析顯示，NGAL、Chil3、S100A8和CP表達(dá)與SCr呈顯著正相關(guān)(r=0.276、0.391、0.789、0.721，均P<0.001)，見圖4。

A、B：成對(duì)比較火山圖確定感染性休克合并AKI后第12小時(shí)或第24小時(shí)與感染性休克NAKI之間的差異變化蛋白 上調(diào)和下調(diào)1.5倍的蛋白質(zhì)分別以紅色/紫色和藍(lán)色表示；C～F：分別為Chil3、NGAL、S100A8和CP的蛋白質(zhì)豐度圖 a:P<0.05，與對(duì)應(yīng)NAKI組比較

表2 ELISA分析NGAL、Chil3、S100A8和CP在AKI和NAKI中的表達(dá)結(jié)果

2.5 生物標(biāo)志物的鑒定

基于4種單一和組合生物標(biāo)志物在12 h和24 h的ROC分析結(jié)果見表3、圖5。標(biāo)志物組合在診斷感染性休克合并AKI具有較大診斷性能，在12 h和24 h的AUC分別為0.901和0.958。

表3 單一和組合生物標(biāo)志物診斷感染性休克合并AKI的性能比較

圖5 感染性休克合并AKI患者12 h(A)和24 h(B)聯(lián)合標(biāo)志物診斷性能的ROC分析

3 討論

3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在識(shí)別潛在的感染性休克合并AKI標(biāo)志物中的應(yīng)用

感染性休克合并AKI可以在沒有明顯的低灌注跡象或沒有血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定的臨床跡象的情況下發(fā)生[8]。因此，迫切需要早期生物標(biāo)志物來及時(shí)診斷和預(yù)測(cè)損傷嚴(yán)重程度。感染性休克通常與多器官損傷相關(guān)，而源自血漿和尿液的傳統(tǒng)感染性休克標(biāo)志物(例如肌酐、尿液濃縮能力)易受非腎臟因素的干擾，因此敏感性和特異性不高[9]。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)在腎臟疾病的研究中有廣闊的前景；不但可能發(fā)現(xiàn)不同腎臟疾病的早期信號(hào)和生物標(biāo)志物，而且也可能對(duì)不同腎臟疾病的預(yù)后判定起指導(dǎo)性的作用[5-6]。在本實(shí)驗(yàn)中，使用UPLC-QTOF/MS研究感染性休克合并AKI患者尿液中代謝物的變化，以識(shí)別潛在的代謝組學(xué)生物標(biāo)志物。全局蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)與之前在許多已知AKI標(biāo)志物(如NGAL)背景下的尿液發(fā)現(xiàn)大體一致[10]。此外，驗(yàn)證了幾種新的和/或研究較少的感染性休克合并AKI標(biāo)記蛋白，包括S100A8、Chil3和CP。全局蛋白質(zhì)組分析顯示，在感染性休克早期階段，與細(xì)胞外基質(zhì)和急性期反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)和與跨膜受體蛋白激酶活性相關(guān)的蛋白質(zhì)增加，與離子、氨基酸和代謝物排泄相關(guān)的蛋白質(zhì)以及與線粒體相關(guān)的蛋白質(zhì)減少。這些變化與組織中的炎癥和纖維化反應(yīng)一致。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的生物標(biāo)志物診斷感染性休克合并AKI的性能

NGAL是一種經(jīng)過驗(yàn)證的腎損傷預(yù)測(cè)因子。在缺血性、膿毒性或移植后AKI下，尿液中NGAL水平迅速增加[11]。本研究中，感染性休克合并AKI患者的尿液NGAL水平較感染性休克NAKI患者顯著增加，表明AKI患者的腎臟出現(xiàn)了明確的損傷。CP是一種含銅的亞鐵氧化物酶，可將Fe2+氧化為其無毒的Fe3+形式。它的表達(dá)在衰老小鼠或消耗高熱量飲食的小鼠中顯示增加[12]，表明這些小鼠中氧化損傷量的增加，需要增強(qiáng)其抗氧化活性。尿CP水平被認(rèn)為是鐮狀細(xì)胞病患者合并慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)的生物標(biāo)志物[13]。本研究中，感染性休克合并AKI患者的尿液CP水平較感染性休克NAKI患者顯著增加，表明膿毒癥后腎臟的氧化應(yīng)激增加。S100A8通過與TLR4結(jié)合介導(dǎo)促炎反應(yīng)損傷相關(guān)的分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMP)[14]，先前研究表明S100A8尿液水平增加與感染性休克有關(guān)[15]。在蛋白質(zhì)組分析中，S100A8在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著增加，表明在感染性休克損傷后腎臟中活性鈣衛(wèi)蛋白的形成逐漸增加[16]。Chil3是哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶家族的成員，盡管它由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞高度分泌，但缺乏幾丁質(zhì)酶活性[17]。Chil3被證明是多種疾病模型(如哮喘和肺纖維化)中炎癥和抗菌反應(yīng)的介質(zhì)，并參與組織重塑和傷口愈合[18-19]。在之前的腎臟疾病模型研究中，一項(xiàng)尿蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，幾丁質(zhì)酶樣蛋白可能是膿毒癥AKI的候選生物標(biāo)志物[20]。最近，已證明臨床AKI患者的尿液中幾丁質(zhì)酶樣蛋白大量增加[21]。另一項(xiàng)研究表明，在小鼠腹腔注射LPS后6 h和24 h，腎臟Chil3上調(diào)[22]?？傊?，本研究概括了之前描述的與膿毒癥相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，并為未來的膿毒癥診斷和治療研究提供了有價(jià)值的候選靶點(diǎn)資源。

本研究采用非靶向代謝組學(xué)初步評(píng)估了患有和未患有AKI的感染性休克個(gè)體代謝物和代謝途徑的代謝變化，確定了12 h和24 h發(fā)生變化的4種潛在標(biāo)志物。對(duì)于這些患者，標(biāo)志物組合作為診斷標(biāo)志物比單個(gè)標(biāo)志物更有效。本研究結(jié)果為探索感染性休克合并AKI患者的潛在生物標(biāo)志物和病理機(jī)制提供了可行的方法。然而，本結(jié)果僅對(duì)用尿蛋白組學(xué)方法探討感染性休克合并AKI的早期生物學(xué)標(biāo)志物的識(shí)別提供了新的思路，未來還需要通過大樣本前瞻性研究來驗(yàn)證這些標(biāo)志物的診斷效能。