文 麗，劉華鋼，羅 軼，賴 玲，陸仕華，秦艷娥（.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所/國家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測與評價重點實驗室，廣西 南寧 500；.廣西壯族自治區(qū)藥品監(jiān)督管理局，廣西 南寧 5009；.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 500；.南寧市第一人民醫(yī)院，廣西 南寧 50000）

三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的主要有效活性成分，治療心血管疾病效果較為顯著，臨床上有多種以PNS為主要成分的制劑用于治療心血管疾病如冠心病、高血壓病、心力衰竭等[1]。PNS腸溶微丸能夠避開胃酸及酶對三七總皂苷的破壞，同時增加其在腸道的吸收，因PNS中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量最高，是質(zhì)量控制中的主要指標成分[2-9]，故實驗選擇該3種皂苷為指標測定和評價對象，建立PNS腸溶微丸的含量測定方法，并對PNS腸溶微丸進行體外釋放度考察[10-18]，為該制劑的質(zhì)量控制奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑PNS（梧州制藥集團股份有限公司，批號：101124）；PNS腸溶微丸（自制，批號：110601，110603，110605）；三七皂苷R1對照品（批號：110745-201619）、人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201731）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-201625）（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用）；甲醇（批號：206409）、乙腈（批號：197164）（美國Fisher Scientific公司，色譜純）；高純水（自制）；Acryl-EZER丙烯酸樹脂腸溶包衣劑（上?？房蛋录夹g有限公司，批號：050323）；空白微丸（上海華高藥用丸芯有限公司，批號：101201）。

1.2 儀器LC-20AD型UHPLC，配備SPD-20A型紫外檢測器（日本島津公司）；XB-C18色譜柱（美國日旭公司）；BP210S電子天平（德國賽多利斯公司）；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；FE28臺式酸度計（梅特勒-托利多集團）；BGB5-10C高效包衣機（瑞安市東方制藥有限公司）；BJ-3智能崩解實驗儀（天津市旭陽儀器設備有限公司）；標準篩（上海篩網(wǎng)廠）。

2 方法與結果

2.1 PNS腸溶微丸（膠囊型）的制備 取三七總皂苷90 g，羥丙基甲基纖維素4.5 g，低取代羥丙基纖維素4.5 g，混勻，用60%乙醇溶解，置恒流泵中，開啟漿葉不斷攪拌。將空白微丸置包衣機中滾動預熱，噴漿液上藥，至長大成丸。完成上藥后再滾轉25 min，噴丙烯酸樹脂腸溶包衣劑進行包衣，至微丸增重20%，停止噴液，繼續(xù)滾轉25 min，取出，45℃下干燥6 h，將篩選出的微丸裝入普通膠囊，即得。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取減壓干燥至恒重的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1各20 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成貯備液。4℃冷藏保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品內(nèi)容物，混勻，研細，取0.19 g（約含PNS 20 mg），精密稱定，至100 mL容量瓶中，加水80 mL，超聲處理15 min，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 空白輔料溶液的配制 按處方組成，取除PNS以外的所有輔料，按制備工藝要求，制成不含PNS的微丸（膠囊型），按供試品溶液制備項下的方法，制成空白輔料溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，流脫程度為：0 min～17 min，25%A；17～18 min，25%A→45%A；18～25 min，45%A→25%A；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：203 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。按上述色譜條件測定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的分離度分別為5.95、4.73、12.09，分離效果良好。理論塔板數(shù)按三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰計算分別為10852.3、12536.3、18825.7。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和空白輔料溶液各20 μL，于上述色譜條件下進樣，記錄色譜圖。結果供試品色譜峰與對照品色譜峰保留時間一致。空白輔料溶液在相應保留時間無色譜峰，表明空白輔料對主成分無干擾。（見圖1）

圖1 HPLC色譜圖

2.4.2 線性關系考察 精密稱取空白輔料6份，再分別精密量取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對照品貯備液適量，按“2.2.2”項下處理，獲得一組標準工作液，精密吸取20 μL，注入超高效液相色譜儀，測定，即得。以濃度峰面積A為橫坐標，以峰面積C為縱坐標進行線性回歸，得到標準曲線方程、相關系數(shù)r和線性范圍。結果三七皂苷R1：C=0.0002A-3.8741（r=0.9995），線性范圍3.477～111.250 μg·mL-1，人參皂苷Rg1：C=0.0002A-1.6865（r=0.9999），線性范圍4.517～114.985 μg·mL-1，人參皂苷Rb1：C=0.0002A-0.8396（r=0.9998），線性范圍4.783～152.100 μg·mL-1，線性關系良好。

2.4.3 精密度試驗 取同一濃度的PNS供試品，重復進樣6次，測得峰面積值。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的RSD分別為0.53%、1.08%、1.37%。表明該方法精密度良好。

2.4.4 檢測限與定量限 檢測限和定量限由信噪比法確定，在上述色譜條件下，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的檢測限分別為0.584、0.631、0.565 μg·mL-1，定量限分別為1.752、1.893、1.695 μg·mL-1。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取PNS腸溶微丸，按“2.2.2”項下處理，供試品溶液于室溫下放置，分別于0、4、8、12、24、48 h測定，考察室溫條件下3種皂苷的穩(wěn)定性。結果顯示：三七皂苷R1在0、4、8、12、24、48 h含量分別為18.68、18.66、18.59、18.57、18.51、18.42 μg·mL-1，RSD為0.52%；人參皂苷Rg1在0、4、8、12、24、48 h含量分別為117.48、117.27、117.09、116.56、116.08、115.34 μg·mL-1，RSD為0.67%；人參皂苷Rb1在0、4、8、12、24、48h含量分別為67.11、67.03、66.77、66.48、66.04、65.48 μg·mL-1，RSD為0.99%。表明供試品溶液在室溫放置48 h，其3種皂苷穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品9份，每份約20 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，精密量取“2.2.2“項下的對照品貯備液，分別加入高、中、低（1.2、1.0、0.8）濃度的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對照品溶液，每個濃度分別按“2.2.2”項下方法制備3個供試品溶液，測定各組分含量，計算加樣回收率。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1平均回收率率分別為101.61%、100.89%、100.23%、RSD分別為1.82%、2.36%、1.45%。表明此測定方法準確度較好。（見表1）

表1 加樣回收率試驗結果（n=9）

續(xù)表1：

2.4.7 樣品含量測定 分別稱取3批腸溶微丸10 g，研細，精密稱取粉末0.17 g（約含PNS 20 mg）置于100 mL容量瓶中，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。取供試品溶液20 μL進行分析，按上述的色譜條件測定，計算三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1的含量，結果3批腸溶微丸中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量分別為12.62、65.39、40.06 mg·g-1，在PNS中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量分別為10.40%、53.01%、32.49%。（見表2）

表2 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量

2.5 PNS腸溶微丸體外釋放度 釋放度測定法根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》通則0931溶出度與釋放度測定法檢測。

2.5.1 酸中釋放度 取0.1 mol/L鹽酸溶液900 mL，注入每個溶出杯中，待溶液溫度恒定在(37.0±0.5)℃，取供試品6粒分別投入溶出杯中，啟動儀器，2 h后在規(guī)定取樣點吸取溶出液適量，濾過，自取樣至濾過應在30 s內(nèi)完成。按上述色譜條件測定。

2.5.2 緩沖液中釋放度 棄去上述各溶出杯中鹽酸溶液，立即加入溫度為（37±0.5）℃的磷酸鹽緩沖液（pH值=6.8）900 mL，啟動儀器，分別于5、15、30、45、60、90 min規(guī)定取樣點吸取溶出液適量，濾過，自取樣至濾過應在30 s內(nèi)完成。按上述色譜條件測定。（見表3、圖2）

表3 3批制劑在酸中、磷酸鹽緩沖液中的釋放度（±s，%，n=6）

表3 3批制劑在酸中、磷酸鹽緩沖液中的釋放度（±s，%，n=6）

批號 組份 酸中2 h pH值=6.8的磷酸鹽緩沖液中時間（min）515 30 45 60 90110601 三七皂苷R1 2.18±1.23 14.11±2.04 25.02±2.6987.18±1.84 98.06±5.34102.91±4.14101.80±6.17人參皂苷Rb1 1.87±0.57 15.38±2.36 36.64±1.3280.27±3.79 98.79±5.06103.86±5.27101.71±4.04人參皂苷Rg1 2.30±0.88 13.01±1.4528.77±3.2780.27±3.79 98.79±5.06103.86±5.27101.71±4.04110603 三七皂苷R1 2.04±0.92 14.44±1.72 30.44±2.5687.76±3.55 98.42±3.92 99.71±4.12 98.65±5.97人參皂苷Rb1 2.09±1.73 15.07±2.32 36.37±3.0689.67±4.39100.63±4.89101.16±5.88101.07±5.48人參皂苷Rg1 2.72±0.92 11.64±2.6229.08±3.9781.25±4.42100.97±3.83102.25±3.48 98.57±5.04110605 三七皂苷R1 2.05±0.74 14.55±1.73 30.47±3.3880.09±4.38 94.92±5.13100.06±5.56 97.32±5.17人參皂苷Rb1 1.97±1.09 16.71±2.97 33.92±3.5386.70±3.49 99.06±4.89101.56±5.72100.36±5.54人參皂苷Rg1 2.19±1.54 15.69±1.5228.99±3.7180.66±4.67100.83±3.09103.87±3.88 99.89±6.29

圖2 3批制劑在緩沖液中的釋放度（pH值=6.8）

結果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在酸中釋放量小于標示量的10%，在pH值=6.8的緩沖液中45 min累積釋放量大于標示量的70%，符合制劑要求。

3 討論

據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)[7-9]，三七總皂苷口服給藥在酸性條件下會降解為苷元，而小腸是其最佳吸收部位，為提高三七總皂苷的口服生物利用度，筆者將其制備成腸溶微丸[19-20]。試驗中考察了加熱回流和超聲提取兩種方法，兩種方法提取效率相當，考慮超聲提取更快捷方便，故采用超聲法提取該制劑中的皂苷類成分。參考相關文獻[18-20]及2020年版《中華人民共和國藥典》，采用HPLC法用乙腈-水梯度洗脫，能同時檢測三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb13個指標成分,且分離度良好，輔料無干擾，檢測時間短，可以準確、快速地實現(xiàn)PNS腸溶微丸的定量測定。在體外釋放度考察中，三七總皂苷腸溶微丸中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1即使在酸液中有溶出釋放，也易被破壞降解而難以檢測出來，因此選擇磷酸鹽緩沖液（pH值=6.8）作為釋放介質(zhì)測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的體外釋放量。筆者以三七總皂苷的胃腸道吸收特性研究為基礎，進行了腸溶制劑的研究，并建立PNS腸溶微丸的指標成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的HPLC含量測定方法，并對3批PNS腸溶微丸進行體外釋放度考察。根據(jù)前期研究[7-9]，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1在PNS原料中的含量分別為9.16%、57.90%與32.57%，制成PNS腸溶微丸后在PNS中的含量為分別為10.40%、53.01%與32.49%，差異不明顯，說明PNS主要有效成分的含量在制備過程中無明顯變化。釋放度測定結果表明，3批制劑的體外釋放度良好，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的釋放行為無明顯差異，符合《中華人民共和國藥典》對腸溶制劑的要求，上述研究結果減少了制劑開發(fā)的盲目性，為今后三七總皂苷口服給藥途徑的研究提供了重要實驗依據(jù)。