黃 桑，林 濤，蒙 凌，王志遠(yuǎn)，曾昭智

（1.廣東藥科大學(xué)附屬第二醫(yī)院/廣州新海醫(yī)院，廣東 廣州 510300；2.廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510006）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷等非心源性疾病時(shí)，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。各種原因引起ALI的發(fā)病機(jī)制、病理變化和臨床過程較相似，共同病理基礎(chǔ)是：肺泡-毛細(xì)血管急性損傷，通透性增強(qiáng)，肺間質(zhì)淤血、滲出、水腫，肺泡透明膜形成和肺泡萎縮，而造成肺通氣與血比例失調(diào)，分流量增加，機(jī)體呈低氧血癥、嚴(yán)重缺氧狀態(tài)，肺部影像學(xué)為非均一性的滲出性病變[1-2]。

目前研究方向主要關(guān)注于對(duì)ALI/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）急性期的療效及機(jī)理，而缺乏對(duì)抗肺纖維化和炎癥因子干預(yù)效果和機(jī)理的研究[3]。七葉皂苷鈉為七葉樹果實(shí)娑羅子的提取物，其性甘、溫，無毒，入脾、肺二經(jīng)，有抗炎功效。本課題擬采用七葉皂苷鈉干預(yù)性治療，通過阻斷轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）介導(dǎo)的信號(hào)通路檢測(cè)急性肺損傷大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）含量變化，了解七葉皂苷鈉對(duì)急性肺損傷大鼠血清炎癥因子的抑制作用，了解急性肺損傷后肺纖維化的進(jìn)程及程度，從而了解七葉皂苷鈉對(duì)損傷肺有無肺保護(hù)作用，特別是對(duì)抑制纖維化有無作用。從而為臨床治療提供可能的新選擇和研究途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只SPF級(jí)健康Wistar大鼠，雄性，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量160～200 g。許可證號(hào)：SCXK（粵）2015-2001。實(shí)驗(yàn)前對(duì)其進(jìn)行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，保證大鼠可自由進(jìn)食、飲水，維持正常的晝夜規(guī)律，設(shè)置環(huán)境濕度50%左右，溫度24℃左右。大鼠所用飼料為標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.2 試劑與藥物 強(qiáng)的松由仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，全稱：醋酸潑尼松片，批號(hào)：150465，片劑，規(guī)格：5 mg；七葉皂苷鈉注射液：山東綠葉制藥有限公司，批號(hào)：160404708，規(guī)格：5 mg；IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、PCⅢ、TGF-β ELISA檢測(cè)試劑盒：上海哈靈生物科技有限公司，批號(hào)：201711；油酸：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2016110142；10%中性福爾馬林：廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150722。TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（AR1002）（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 儀器FA2004B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司），HZT-A1000電子天平（廈門華志科學(xué)儀器有限公司），SB3200型超聲波清洗機(jī)（必能信超聲上海有限公司），RM23235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡儀器有限公司LEICA），AE2000倒置顯微鏡（廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）、HCP246恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)美墨爾特有限公司Memmert），3K15冷凍離心機(jī)（德國(guó)希格瑪實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司Sigma Laborzentrifugen GmbH），Infinite 200 pro酶標(biāo)儀（瑞士帝肯有限公司TECAN），全自動(dòng)生化分析儀Roche Hitachi917型（日本奧林巴斯株式會(huì)社Olympus），血?dú)夥治鰞x（美國(guó)雅培有限公司ABBOTT），F(xiàn)orma902超低溫冰箱（美國(guó)賽默飛世爾公司Thermo Fisher）。

2 方 法

2.1 分組與造模 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒋笫箅S機(jī)分為4組：空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組（七葉皂苷鈉組）。給藥方法：空白組經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水0.13 mL/kg作為正常對(duì)照，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組分別給予注射油酸0.13 mL/kg，12 h后經(jīng)尾動(dòng)脈取血0.2 mL，立即用手持式血?dú)夥治鰞x行血?dú)夥治霾⒋蛴〗Y(jié)果，以氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）≤300為造模成功[4]。

2.2 實(shí)驗(yàn)給藥 模型成功后實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尾靜脈注射七葉皂苷鈉注射液（4 mg/kg），空白組、模型組注射生理鹽水（2 mL/kg），陽(yáng)性對(duì)照組按照3.6 mg/kg的劑量給予強(qiáng)的松，1次/d，連續(xù)14 d，期間對(duì)大鼠活動(dòng)、飲食及體重密切觀察。分別于給藥后第14 d處死各組大鼠，并按設(shè)計(jì)要求留取標(biāo)本。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 大鼠肺纖維化的生理指標(biāo) 測(cè)量各鼠體質(zhì)量，然后用剪刀先剪去劍突處鼠毛，用酒精消毒皮膚，以3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉，持5 mL注射器針頭行向上進(jìn)針刺入心臟采血5～6 mL，離心后取血清保存至-20℃冰箱內(nèi)。取肺組織：打開胸腔，分離肺組織，予電子天平稱重測(cè)量。切取右肺在生理鹽水中漂洗干凈，置于甲醛溶液中固定，后經(jīng)脫水、透明、浸蠟和包埋等制作成石蠟組織塊和切片。

2.3.2 大鼠肺組織HE染色檢查 石蠟切片后HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化。

2.3.3 大鼠肺泡灌洗中炎癥因子水平 檢測(cè)肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10，檢測(cè)方法主要參照試劑盒說明書。

2.3.4 大鼠肺組織信號(hào)通常分子蛋白的表達(dá) 肺組織采用免疫組化法，觀察空白組、模型組、實(shí)驗(yàn)組3組大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、Smad蛋白2（Smad2）、Smad蛋白3（Smad3）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-sma）表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺纖維化的生理指標(biāo)比較 空白組大鼠外觀基本正常，肺組織為粉紅色，肺泡彈性良好；模型組大鼠肺組織部分呈現(xiàn)灰白色，實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺臟顏色較模型組紅潤(rùn)。模型組大鼠的肺系數(shù)、炎癥程度、纖維化程度均高于其他3組（P＜0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的的肺系數(shù)、炎癥程度、纖維化程度均高于空白組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的肺系數(shù)、炎癥程度、纖維化程度對(duì)比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠肺纖維化的生理指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠肺纖維化的生理指標(biāo)比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05

組別 肺系數(shù)（mg/g） 炎癥程度 纖維化程度空白組 0.46±0.05a 1.09±0.07a 0.17±0.04a模型組 1.31±0.29 3.51±0.33 6.75±0.79陽(yáng)性對(duì)照組 0.49±0.07a 1.62±0.20a 0.12±0.03a實(shí)驗(yàn)組 0.52±0.11a 1.71±0.21a 0.18±0.10a

3.2 各組大鼠肺組織HE染色檢查結(jié)果HE染色檢查顯示：空白組大鼠肺泡壁較薄，具有完整的肺泡結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或充血等情況；模型組大鼠肺泡壁變厚，眾多肺泡出現(xiàn)塌陷，部分可見融合成大肺泡，肺泡中具有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或充血等情況；陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的炎癥程度相較于模型組顯著減輕，與空白組則無明顯差異；陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的仍可保持肺泡結(jié)構(gòu)尚，但肺泡間隔存在局部變厚，肺泡較少存在融合。（見圖1）

圖1 各組大鼠HE染色檢查結(jié)果（×400）

3.3 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較 陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10均低于模型組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠肺泡灌洗液中，IL-6明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），兩組大鼠其它指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較（±s，ng/mL-1）

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較（±s，ng/mL-1）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，bP＜0.05

組別 TNF-α IL-1β IL-6 IL-10空白組 77.39±15.32a 201.57±18.24a 102.47±17.49a 93.38±15.76a模型組 105.31±18.27221.71±25.47 127.16±19.83123.58±19.83陽(yáng)性對(duì)照組89.75±16.57a 211.45±21.80a 114.47±15.81a 91.74±16.86a實(shí)驗(yàn)組 92.48±16.41a 210.07±20.94a 98.89±13.43a b 90.59±15.27a

3.4 各組大鼠肺組織TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma表達(dá)比較 模型組大鼠肺組織TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma表達(dá)均高于空白組（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織均低于模型組（P＜0.05）。（見圖2～5，表3）

表3 各組信號(hào)通路分子蛋白的表達(dá)（±s）

表3 各組信號(hào)通路分子蛋白的表達(dá)（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05

組別 TGF-β Smad2 Smad3 α-sma空白組1.521±0.202a 1.675±0.267a 1.538±0.287a 1.435±0.219a模型組3.175±0.4593.899±0.564 3.873±0.743 2.849±0.513實(shí)驗(yàn)組1.784±0.243a 2.243±0.0.471a 2.476±0.372a 1.998±0.234a

圖2 各組大鼠肺組織TGF-β免疫組化染色結(jié)果（×400）

圖3 各組大鼠肺組織Smad2免疫組化染色結(jié)果（×400）

圖4 各組大鼠肺組織Smad3免疫組化染色結(jié)果（×400）

圖5 各組大鼠肺組織α-sma免疫組化染色結(jié)果（×400）

4 討論

ALI和ARDS是導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全或衰竭的重要原因。它們共同病理基礎(chǔ)是：肺泡-毛細(xì)血管急性損傷，通透性增強(qiáng)，肺間質(zhì)淤血、滲出、水腫，肺泡透明膜形成和肺泡萎縮，而造成肺通氣與血比例失調(diào)，分流量增加，機(jī)體呈低氧血癥、嚴(yán)重缺氧狀態(tài)[5-6]。

在急性肺損傷早期，機(jī)體通過激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，以及其產(chǎn)生的炎癥因子直接作用于肺泡膜而引起肺損傷。有研究[7]表明，ALI/ARDS時(shí)，炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生并相互作用，形成網(wǎng)絡(luò)，且斷循環(huán)促進(jìn)，形成“瀑布樣”反應(yīng)，血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量明顯增高?，F(xiàn)研究已證實(shí)ALI和ARDS是由多種炎性介質(zhì)及效應(yīng)細(xì)胞共同參與的結(jié)果，雖然激素的規(guī)范化在炎癥早期發(fā)揮著重要作用，但其最終治療效果并不理想，死亡率依舊高居不下，不僅因?yàn)榧膊∵M(jìn)展過程迅速，而且其內(nèi)在的發(fā)病機(jī)制至今尚無統(tǒng)一定論[8]。

肺纖維化形成是炎癥因子通過作用下黏附于肺毛細(xì)血管內(nèi)皮，其微血管通透性增高，進(jìn)而導(dǎo)致肺泡滲出中富含蛋白質(zhì)肺水腫及透明膜形成，同時(shí)伴有肺間質(zhì)纖維化，而肺纖維化可能是導(dǎo)致肺功能受損的關(guān)鍵。肺纖維化病理過程主要包括早期損傷、炎癥免疫反應(yīng)、成纖維化3個(gè)階段，雖然纖維增殖是正常的修復(fù)過程，但如果不及時(shí)干預(yù)可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果[9]。在細(xì)胞水平及動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，肺纖維化起源于肺損傷并伴之發(fā)展，因此在肺損傷早期實(shí)現(xiàn)肺纖維化形成干預(yù)，可有效的延緩及控制肺纖維化的形成。在此過程中除了涉及到巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞外，還與多種細(xì)胞因子及趨化因子密切相關(guān)，如TGF-β、TNF-α、白細(xì)胞介素（IL）、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）[10]。

已有研究[11-13]表明，TGF-β通過Smads通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)肺纖維化中I型膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的調(diào)控，不僅如此，TGF-β還可通過調(diào)節(jié)MMPs、TIMPs等的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)肺纖維化過程的調(diào)節(jié)。由此可見，TGF-β致纖維化形成過程的關(guān)鍵性纖維化因子，通過阻斷TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中的某些環(huán)節(jié)來治療或減緩肺纖維化疾病已成為人們最近研究的熱點(diǎn)。羥脯氨酸（HYP）是機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一，為膠原纖維所特有，其含量的變化可作為衡量膠原組織代謝的重要指標(biāo)，可判斷纖維化的程度[14]。

七葉皂苷鈉能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生ACTH和COR，促進(jìn)血管壁分泌PGF，具有類糖皮質(zhì)激素抗炎、抗?jié)B出、消腫脹作用，其能穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞和清除氧自由基，提高靜脈張力，促進(jìn)淋巴回流，改善微循環(huán)等，而用于治療多種臨床疾病[2]。劉朝普等[15]研究七葉皂苷鈉對(duì)油酸制備急性肺損傷大鼠模型的療效觀察，通過檢測(cè)PaO、W/D、血漿及肺勻漿中SOD、MDA等，結(jié)果表明不同劑量七葉皂苷鈉對(duì)急性肺損傷模型大鼠均有抗炎、抗?jié)B出作用。也有研究表明，七葉皂苷鈉可顯著抑制機(jī)體炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生，清除急性肺水腫，在創(chuàng)傷性急性肺損傷早期應(yīng)用治療效果明顯。亦有研究[16]表明，七葉皂苷鈉能有效預(yù)防嚴(yán)重急性放射性肺損傷，而無激素類不良反應(yīng)，且能提高患者生活質(zhì)量。目前研究方向主要關(guān)注于對(duì)ALI/ARDS急性期的療效及機(jī)理，而缺乏對(duì)ALI/ARDS遠(yuǎn)期（即ALI后期，抗肺纖維化）干預(yù)效果和機(jī)理的研究[17]。

本課題采用七葉皂苷鈉干預(yù)性治療，通過檢測(cè)急性肺損傷大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量變化，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10均低于模型組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠肺泡灌洗液中，IL-6明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05），說明七葉皂苷鈉干預(yù)性治療明顯降低其炎性因子水平。通過本次對(duì)大鼠肺系數(shù)、炎癥程度、纖維化程度的觀察說明七葉皂苷鈉能對(duì)大鼠肺纖維化的生理指標(biāo)產(chǎn)生積極的影響，這與娑羅子的抗炎、消腫功效相吻合。HE染色檢查顯示空白組大鼠肺泡壁較薄，模型組大鼠肺泡壁變厚，眾多肺泡出現(xiàn)塌陷，而陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的炎癥程度相較于模型組明顯減輕，與空白組則無明顯差異；陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的仍可保持肺泡結(jié)構(gòu)尚，但肺泡間隔存在局部變厚，肺泡較少存在融合。Masson染色檢查也顯示模型組大鼠雙肺喪失了絕大部分肺泡結(jié)構(gòu)，可見藍(lán)色膠原大量沉積于間質(zhì)，肺部實(shí)變，其纖維化程度相較于陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠明顯增加；陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠肺泡間隔的膠原沉積情況較輕，其纖維化程度與空白組相比無明顯差異。這都說明七葉皂苷鈉對(duì)大鼠肺纖維化產(chǎn)生了積極的療效。

大量研究[18]表明，肺纖維化的發(fā)生機(jī)制主要與早期的炎癥反應(yīng)和隨后的纖維化增生有關(guān)。TGF-β信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要因素，很多抗肺纖維化治療的藥物都以該通路及通路中的重要分子蛋白Smad2、Smad3、α-sma表達(dá)密切相關(guān)[19]。本研究以信號(hào)通路TGF-β及關(guān)鍵分子蛋白Smad2、Smad3、α-sma為檢測(cè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺組織TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma表達(dá)均高于空白組（P<0.05），而實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中蛋白表達(dá)均下降（P<0.05）。說明七葉皂苷鈉對(duì)TGF-β信號(hào)通路有明顯阻攔作用。

綜上，七葉皂苷鈉能明顯改善大鼠肺纖維化的生理指標(biāo)，降低肺纖維化模型大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平，能明顯抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路，為臨床治療急性肺損傷提供了新的選擇和研究途徑，但其治療機(jī)制需進(jìn)一步研究。