李玉琴,俄洛吉,鞏海鳳,汪玉鳳,曾湘輝
(青海省人民醫(yī)院,青海 西寧 810000)
妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus,GDM)是一種常見的妊娠并發(fā)癥,在妊娠期間會出現(xiàn)自發(fā)性慢性高血糖癥。此類高血糖癥大部分因在慢性胰島素抵抗背景下,胰腺β細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致葡萄糖耐量受損[1]。GDM的常見致病因素有肥胖(超重)、飲食、高齡產(chǎn)婦糖尿病家族史及胰島素抵抗等,已上升為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,影響全球約20%妊娠者,且患病率不斷攀升[2]。通常GDM會在分娩后有所消退,但在發(fā)生期間也伴隨其他并發(fā)癥(如母體心血管疾病、2型糖尿病及巨嬰兒等)[3]。迄今為止,臨床上尚未出現(xiàn)能被大眾廣泛接受的GDM治療或預(yù)防方案。常用干預(yù)方式為飲食或運動搭配胰島素治療,但體內(nèi)出現(xiàn)胰島素抵抗會導(dǎo)致治療效果受限。因此,尋求安全、有效且易于施用的新療法迫在眉睫。山藥作為傳統(tǒng)藥食同源性植物,具有多種生物活性和生理學(xué)功能,引起了學(xué)者廣泛關(guān)注和研究[4]。已有研究證實,山藥多糖具有降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老等藥理作用[5]。本研究通過建立GDM模型,分析山藥多糖對GDM大鼠影響,以期為相關(guān)藥品研發(fā)和GDM治療提供參考依據(jù)。
1.1 實驗動物SPF級SD雌性大鼠60只和雄性大鼠30只,6周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購自廣東藥康生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2020-0054,購入后保持室內(nèi)溫度(24±1)℃,空氣相對濕度(60±10)%,光照晝夜交替循環(huán)12 h,自由攝食水,飼養(yǎng)1周。本實驗對動物的處置符合3R原則,并經(jīng)醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)。
1.2 藥物與試劑 山藥多糖(批號:20201109,純度:98%)購自上海永葉生物科技有限公司;鹽酸二甲雙胍(國藥準(zhǔn)字H11021518,批號:20200921)購自北京京豐制藥集團;鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(批號:20200631)購自北京Solarbio公司;白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(批號:20201105)、白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)ELISA試劑盒(批號:20201018)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(批號:20201206)均購自美國R&D公司;蛋白BCA試劑盒(批號:20200225)購自美國Sigma公司;兔抗鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)多抗(批號:ab263899)、硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)單抗(批號:ab188865)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(microtubule-associated protein light chain 3B,LC3B)多抗(批號:ab192890)、Beclin自噬蛋白1(Beclin1)多抗(批號:ab207612)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單抗(批號:ab9485)、羊抗兔二抗-HRP(批號:ab205718)均購自英國Abcam公司。
1.3 主要儀器Omnitest EZ型血糖儀(德國貝朗醫(yī)療有限公司);UniCel DxI 800型全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司);7500 Fast型實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific公司);BIO-RAD電泳儀、垂直電泳槽均購自美國Santa Cruz公司。
1.4 造模與分組 在造模前大鼠使用基礎(chǔ)飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,取50只雌性大鼠飼養(yǎng)高脂肪蔗糖飲食8周后,將其和雄性大鼠合籠過夜,其中籠內(nèi)大鼠雌雄比例2∶1。次日,顯微鏡下觀察到雌性大鼠陰道處出現(xiàn)精子或黏液栓現(xiàn)象,即妊娠成功,并記作妊娠第1天。42只雌性大鼠成功受孕,8只未受孕。42只受孕大鼠在妊娠5 d后禁食12 h,腹腔注射STZ溶液(35 mg/kg)誘導(dǎo)GDM模型[6]。72 h后用血糖儀檢測雌鼠空腹血糖(fasting blood glucose,F(xiàn)BG)水平,若FBG>16.7 mmol/L,即提示造模成功[7]。取造模成功40只雌鼠(2只無癥狀予以剔除),按隨機數(shù)字表法分為模型組、山藥多糖低劑量組、山藥多糖高劑量組、陽性藥物組,每組10只。剩余10只未造模雌鼠作為正常組,正常飲食、妊娠,腹腔注射無菌生理鹽水。
1.5 實驗給藥 造模成功后,使用山藥多糖進(jìn)行干預(yù),依據(jù)參考文獻(xiàn)[8]用量,山藥多糖低、高劑量組依次按照200、400 mg/kg劑量灌胃,陽性藥物組使用鹽酸二甲雙胍按照200 mg/kg劑量灌胃,正常組和模型組則給予等體積無菌生理鹽水灌胃,1次/d,連續(xù)給藥6周。
1.6 觀察指標(biāo)
1.6.1 血糖、胰島素水平檢測 末次給藥后24 h,分別采用血糖儀、全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測雌鼠血清FBG和空腹胰島素(fasting semm insulin,F(xiàn)INs),并依據(jù)穩(wěn)態(tài)模型評估法計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR)。HOMA-IR[9]=FBG(mmol/L)×FINs(μIU/mL)/22.5。
1.6.2 血清細(xì)胞相關(guān)因子檢測 血糖、胰島素指標(biāo)檢測結(jié)束后,采集雌鼠血液,經(jīng)4000 r/min離心10 min,離心半徑20 cm,取血清。ELISA法測定血清IL-1β、IL-18、IL-6含量,嚴(yán)格按照IL-1β、IL-18、IL-6 ELISA試劑盒說明書操作。
1.6.3 Transwell法檢測胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲 脫頸椎處死大鼠,取胎盤并分離滋養(yǎng)層組織,切片(約1 mm×1 mm),37℃水浴,0.25%胰蛋白酶消化3次,每次10min,3000r/min離心5min,去沉淀得細(xì)胞懸液,PBS洗滌2次,采用10%胎牛血清DMEM/F12重懸細(xì)胞,接種培養(yǎng)板并置于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀況,當(dāng)細(xì)胞攀爬至培養(yǎng)皿底面積約90%進(jìn)行傳代培養(yǎng),取第三代滋養(yǎng)層細(xì)胞,配制1×105個/mL細(xì)胞懸液,Matrigel基質(zhì)膠(1:4稀釋)包被Transwell上室,室溫放置過夜至凝固,將配制好的細(xì)胞懸液接種至Transwell小室,其中上室加入100 μL細(xì)胞懸液,下室加入500 μL含有10% FBS的培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48 h,4%多聚甲醛固定30 min、結(jié)晶紫染色20 min,顯微鏡下隨機取5個視野觀察、計數(shù),取平均值。
1.6.4 qRT-PCR檢測胎盤組織Beclin1 mRNA、LC3B mRNA、TXNIP mRNA和NLRP3 mRNA水平 取胎盤組織,勻漿,Trizol法提取RNA,測純度及濃度,逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系:Taq聚合酶1.6 μL,上下游引物0.8 μL,模板cDNA5 μL,雙蒸水12.6 μL。擴增條件:預(yù)變性(95℃,30 s),變性(95℃,5 s),退火(59℃,30 s),共40個循環(huán),加熔解曲線,降溫(50℃,30 s)。GAPDH為內(nèi)參對照,數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法,重復(fù)多次,取Ct均值。引物序列見表1。
表1 引物序列
1.6.5 Western blotting法檢測胎盤組織Beclin1、LC3B、TXNIP、NLRP3蛋白水平 取胎盤組織,加RIPA裂解緩沖液,5000 r/min離心15 min,離心半徑20 cm,取上清,蛋白BCA試劑盒測定總蛋白濃度,待測蛋白樣品電泳分離(100 V,80 min),轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,樣品與Beclin1(1∶200)、LC3B(1∶1000)、TXNIP(1∶500)、NLRP3(1∶1000)一抗4℃過夜孵育,TBST緩沖液洗膜,加二抗室溫孵育(HRP標(biāo)記IgG,1∶2000)2 h,洗膜、曝光、顯影。Image J軟件測樣品和GAPDH條帶灰度值。目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量計算,即目標(biāo)條帶和GAPDH條帶灰度比值。1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較進(jìn)行LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組大鼠血清FBG、FINs、HOMA-IR水平比較 與正常組比較,模型組大鼠血清FBG、FINs、HOMA-IR水平均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,山藥多糖低劑量組、山藥多糖高劑量組、陽性藥物組大鼠血清FBG、FINs、HOMA-IR水平均明顯降低(P<0.05);與山藥多糖低劑量組比較,山藥多糖高劑量組、陽性藥物組大鼠血清FBG、FINs、HOMA-IR水平均明顯降低(P<0.05),且陽性藥物組低于山藥多糖高劑量組(P<0.05)。(見表2)
表2 各組大鼠血清FBG、FINs、HOMA-IR水平比較(±s)
表2 各組大鼠血清FBG、FINs、HOMA-IR水平比較(±s)
注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與山藥多糖低劑量組比較,cP<0.05;與山藥多糖高劑量組比較,dP<0.05
組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)FBG(mmol/L)FINs(μIU/mL) HOMA-IR正常組 10 - 4.64±1.54 1.69±0.43 0.35±0.11模型組 10 - 18.75±2.17a 4.90±0.78a 4.08±0.20a山藥多糖低劑量組10 200 14.56±1.90ab 3.83±0.70ab 2.48±0.17ab山藥多糖高劑量組10 400 10.43±1.71abc 2.78±0.65abc 1.29±0.15abc陽性藥物組 10 200 6.82±1.63abcd 1.92±0.56abcd 0.58±0.13abcd F 100.617 44.734 986.516 P 0.000 0.000 0.000
2.2 各組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6水平比較 與正常組比較,模型組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6水平均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,山藥多糖低劑量組、山藥多糖高劑量組、陽性藥物組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6水平均明顯降低(P<0.05);與山藥多糖低劑量組比較,山藥多糖高劑量組、陽性藥物組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6水平均明顯降低(P<0.05),且陽性藥物組低于山藥多糖高劑量組(P<0.05)。(見表3)
表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6水平比較(±s)
表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6水平比較(±s)
注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與山藥多糖低劑量組比較,cP<0.05;與山藥多糖高劑量組比較,dP<0.05
組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)IL-1β(ng/mL)IL-18(ng/mL)IL-6(ng/mL)正常組 10 - 23.91±6.41 36.41±6.34 68.73±7.92模型組 10 - 78.56±6.69a 86.57±6.58a 158.24±8.97a山藥多糖低劑量組10 200 59.64±6.57ab 73.54±6.46ab 125.43±8.49ab山藥多糖高劑量組10 400 46.93±6.38abc 60.83±6.25abc 101.32±8.61abc陽性藥物組 10 200 34.27±6.25abcd 48.62±5.97abcd 84.69±8.25abcd F 109.998 98.089 173.356 P 0.000 0.000 0.000
2.3 各組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較 與正常組比較,模型組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.05);與模型組比較,山藥多糖低劑量組、山藥多糖高劑量組、陽性藥物組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲數(shù)目均明顯增加(P<0.05);與山藥多糖低劑量組比較,山藥多糖高劑量組、陽性藥物組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲數(shù)目均明顯增加(P<0.05),且陽性藥物組多于山藥多糖高劑量組(P<0.05)。(見表4、圖1)
圖1 各組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲情況比較(×400)
表4 各組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲數(shù)目比較(±s)
表4 各組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲數(shù)目比較(±s)
注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與山藥多糖低劑量組比較,cP<0.05;與山藥多糖高劑量組比較,dP<0.05
組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg) 侵襲細(xì)胞數(shù)目(個)正常組 10 - 185.60±19.25模型組 10 - 40.80±11.52a山藥多糖低劑量組10 200 71.40±13.47a b山藥多糖高劑量組10 400 103.60±15.30a b c陽性藥物組 10 200 145.20±17.18a b c d F 34.651 P 0.000
2.4 各組大鼠胎盤組織Beclin1 mRNA、TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA相對表達(dá)量及LC3II/LC3I比較 與正常組比較,模型組大鼠胎盤組織Beclin1 mRNA、TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA相對表達(dá)量及LC3II/LC3I均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,山藥多糖低劑量組、山藥多糖高劑量組、陽性藥物組大鼠胎盤組織Beclin1 mRNA、TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA相對表達(dá)量及LC3II/LC3I均明顯降低(P<0.05);與山藥多糖低劑量組比較,山藥多糖高劑量組、陽性藥物組大鼠胎盤組織Beclin1 mRNA、TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA相對表達(dá)量及LC3II/LC3I均明顯降低(P<0.05),且陽性藥物組低于山藥多糖高劑量組(P<0.05)。(見表5)
表5 各組大鼠胎盤組織Beclin1 mRNA、TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA相對表達(dá)量及LC3II/LC3I比較(±s)
表5 各組大鼠胎盤組織Beclin1 mRNA、TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA相對表達(dá)量及LC3II/LC3I比較(±s)
注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與山藥多糖低劑量組比較,cP<0.05;與山藥多糖高劑量組比較,dP<0.05
組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)Beclin1 mRNA LC3II/LC3I TXNIP mRNA NLRP3 mRNA正常組 10 - 0.54±0.05 0.50±0.02 0.39±0.03 0.45±0.04模型組 10 - 0.98±0.06a 0.93±0.05a 0.80±0.05a 0.87±0.05a山藥多糖低劑量組10 200 0.85±0.04ab 0.81±0.03ab 0.70±0.03ab 0.77±0.04ab山藥多糖高劑量組10 400 0.74±0.05a bc 0.70±0.04a bc 0.61±0.05a bc 0.65±0.05a bc陽性藥物組 10 200 0.63±0.04abcd 0.60±0.03abcd 0.50±0.02a bc d 0.56±0.03a bc d F 64.343 113.770 90.451 75.824 P 0.000 0.000 0.000 0.000
2.5 各組大鼠胎盤組織Beclin1、TXNIP、NLRP3蛋白相對表達(dá)量及LC3II/LC3I比較 與正常組比較,模型組大鼠胎盤組織Beclin1、TXNIP、NLRP3蛋白相對表達(dá)量和LC3II/LC3I均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,山藥多糖低劑量組、山藥多糖高劑量組、陽性藥物組胎盤組織Beclin1、TXNIP、NLRP3蛋白相對表達(dá)量和LC3II/LC3I均明顯降低(P<0.05);與山藥多糖低劑量組比較,山藥多糖高劑量組、陽性藥物組大鼠胎盤組織Beclin1、TXNIP、NLRP3蛋白相對表達(dá)量和LC3II/LC3I均明顯降低,且陽性藥物組低于山藥多糖高劑量組(P<0.05)。(見表6、圖2)
表6 各組大鼠胎盤組織Beclin1、TXNIP、NLRP3蛋白相對表達(dá)量及LC3II/LC3I比較(±s)
注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與山藥多糖低劑量組比較,cP<0.05;與山藥多糖高劑量組比較,dP<0.05
組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)Beclin1 LC3II/LC3I TXNIP NLRP3正常組 10 - 0.45±0.040.37±0.05 0.21±0.03 0.30±0.03模型組 10 - 0.91±0.06a 0.85±0.04a 0.76±0.05a 0.80±0.04a山藥多糖低劑量組10 200 0.80±0.05ab 0.74±0.06ab 0.65±0.04ab 0.70±0.05ab山藥多糖高劑量組10 400 0.69±0.04abc 0.62±0.05abc 0.53±0.05abc 0.59±0.04abc陽性藥物組 10 200 0.56±0.03abcd 0.51±0.04abcd 0.40±0.04abcd 0.45±0.05abcd F 82.525 75.148 126.786 108.159 P 0.000 0.000 0.000 0.000
圖2 各組大鼠胎盤組織Beclin1、TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)及LC3II/LC3I免疫印跡圖
GDM被定義為“妊娠中期和晚期發(fā)生的葡萄糖耐受不良,且出現(xiàn)不同程度高血糖癥”,并依據(jù)妊娠期高血糖狀態(tài)分為GDM、顯性糖尿病和孕前糖尿病[10]。在妊娠中期和晚期,拮抗胰島素作用使胎盤激素增加進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗增加。此機制目的是為胎兒提供葡萄糖,而胰島素分泌逐漸增加使女性正常葡萄糖水平得以維持。β細(xì)胞胰島素分泌無法補償妊娠誘導(dǎo)胰島素抵抗,或與受損β細(xì)胞功能相結(jié)合,則導(dǎo)致GDM發(fā)生[11]。
GDM是一種代謝性疾病,也是一種低度炎癥反應(yīng)。GDM可能會導(dǎo)致胎盤發(fā)育不良、流產(chǎn)或胎兒畸形,這與高血糖癥密不可分。胎盤是胚胎發(fā)育關(guān)鍵場所,也是妊娠期間母體和胎兒間重要連結(jié)組織,它可以表達(dá)幾乎所有已知細(xì)胞因子(如能夠影響自噬TNF-α、白細(xì)胞介素家族等),其正常生理功能和滋養(yǎng)層細(xì)胞息息相關(guān)[12]。此外,滋養(yǎng)層細(xì)胞作為重要組成細(xì)胞,其遷移、侵襲是一種正常生理現(xiàn)象,具有固定胎盤與胎兒作用[13]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,山藥多糖高、低劑量組大鼠血清FBG、FINs、HOMA-IR、IL-1β、IL-18、IL-6水平均明顯降低,炎癥反應(yīng)得以改善;Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,山藥多糖高、低劑量組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲數(shù)目均多于模型組,提示山藥多糖能抑制GDM大鼠炎癥細(xì)胞因子分泌,增強細(xì)胞侵襲能力。
自噬即在真核細(xì)胞中維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的催化過程,包括降解受損大分子和細(xì)胞器中細(xì)胞質(zhì)成分,在胎盤形成過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[14]。自噬可維持自身體內(nèi)平衡,避免出現(xiàn)疾病、衰老和發(fā)育不良,且能反映細(xì)胞內(nèi)代謝水平(如葡萄糖代謝)。當(dāng)胎盤細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)不平衡時,滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬現(xiàn)象增加。在自噬過程中,自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3參與了自噬體發(fā)育和成熟[15]。缺氧、營養(yǎng)缺乏、免疫信號刺激或炎癥刺激可通過各種信號通路誘導(dǎo)自噬,維持細(xì)胞正常代謝,尤其是滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬抑制可誘導(dǎo)IL-1β分泌,從而引發(fā)母體過度激活的炎癥反應(yīng)[16]。NLRP3是一類最具代表性炎癥小體,可在多數(shù)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。它不僅參與細(xì)胞炎癥反應(yīng),在細(xì)胞生物學(xué)行為中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用[17]。NLRP3作為免疫調(diào)控重要因子,可通過活化誘導(dǎo)促炎因子成熟,引起細(xì)胞或組織炎癥損傷[18-19]。研究[20]發(fā)現(xiàn)下調(diào)TXNIP表達(dá)會導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞NLRP3表達(dá)降低,細(xì)胞侵襲能力增強。自噬反應(yīng)可雙向調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活,自噬反應(yīng)對炎癥小體激活是促進(jìn)或抑制似乎和自噬程度相關(guān)。此外,炎癥小體激活后也可以促進(jìn)或抑制自噬反應(yīng)。但目前具體雙向調(diào)控機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,山藥多糖高、低劑量組大鼠胎盤組織Beclin1、TXNIP、NLRP3的mRNA和蛋白相對表達(dá)量及LC3II/LC3I均明顯降低,說明山藥多糖能降低GDM大鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞炎癥反應(yīng)和自噬現(xiàn)象,揭示山藥多糖可能通過抑制NLRP3通路,進(jìn)而調(diào)控GDM大鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬和侵襲。
綜上所述,山藥多糖可改善GDM大鼠炎癥反應(yīng),抑制胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬,增強細(xì)胞侵襲能力。山藥多糖可能通過調(diào)控NLRP3通路發(fā)揮作用。