吳睿哲，吳 潔，劉 凱，葛殊瑋，伍 強，王 凡，曾景奇

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.寧鄉(xiāng)市中醫(yī)院，湖南 寧鄉(xiāng)410601）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種女性絕經(jīng)后性激素分泌缺乏導(dǎo)致成骨-破骨平衡被打破，出現(xiàn)骨吸收大于骨形成最終導(dǎo)致以骨量減少、骨密度（bone mineral density，BMD）降低、骨組織微環(huán)境及微結(jié)構(gòu)改變?yōu)樘卣鞯某Ｒ娫l(fā)性疾病。隨著雌激素分泌的驟然變化，部分女性絕經(jīng)后出現(xiàn)脂代謝功能的紊亂，極易出現(xiàn)體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）的變化。有研究證明，BMI與BMD存在正相關(guān)性[1]，并被證實具有抑制骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）進展的作用，且有研究者認為機械性的應(yīng)力刺激可增強骨重塑過程從而對抗BMI的增加[2]。隨著細胞分子層面上研究的深入，脂肪組織不再被認為是一種單純的儲能與供能組織；脂肪組織具有旁分泌、自分泌、免疫活性等功能，脂肪因子（adipokine）作為脂肪細胞分泌的多種信號分子已被證實能通過成骨-成脂平衡影響骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的分化。瘦素（leptin，LEP）、脂聯(lián)素（adiponectin，ADP）是脂肪因子家族的重要成員，兩者及其相應(yīng)受體參與了調(diào)控成骨細胞的成骨-破骨平衡[3]。

近年來，對補腎類中藥防治骨質(zhì)疏松癥機制作用研究取得了一定的成果[4]，其中補腎類代表藥物骨碎補在防治OP、骨組織重建修復(fù)等方面的作用逐漸引起眾多學(xué)者的關(guān)注。骨碎補有效成分骨碎補總黃酮的成分復(fù)雜，與脂肪因子作用防治PMOP的研究較少，故本研究通過分子對接對骨碎補總黃酮含有的多個主要活性成分與ADP、LEP的結(jié)合可能性進行預(yù)估，并通過動物實驗探討骨碎補總黃酮對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清ADP、血清LEP及BMD的影響，旨在為骨碎補防治PMOP的具體作用機制研究提供思路，并為臨床推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 分子對接

1.1.1 骨碎補總黃酮有效成分篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https://tcmsp-e.com/）中以“骨碎補”作為關(guān)鍵詞，進行藥物有效化學(xué)成分的篩選。根據(jù)ADME原則選取滿足口服生物利用度（oral bioavailibility，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的化學(xué)成分，并通過分子結(jié)構(gòu)篩選出有效成分中的黃酮類成分。

1.1.2 活性成分與核心靶點的分子對接 選取骨碎補總黃酮中關(guān)鍵成分與LEP、ADP進行分子對接。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www1.rcsb.org/）中下載LEP（PDB-ID：1AX8）及ADP（PDB-ID：6U66）的pdb格式結(jié)構(gòu)文件；根據(jù)篩選結(jié)果在ZINC小分子數(shù)據(jù)庫（https://zinc.docking.org/）中下載骨碎補總黃酮關(guān)鍵成分的mol2格式結(jié)構(gòu)文件。運用AutoDockTools1.5.6對骨碎補總黃酮關(guān)鍵成分與LEP、ADP進行分子對接，并用Pymol2.4.0對分子對接結(jié)果進行可視化呈現(xiàn)。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物6個月齡SPF級雌性、健康、成年、未孕SD大鼠40只，體質(zhì)量（400±20）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心統(tǒng)一購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009。在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗室中進行實驗操作，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2）℃，濕度（65±5）%，光照/黑暗12 h交替，自由飲食。取材時將大鼠麻醉處死。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審核批準，批準編號：LL2020092504，實驗過程中參照國家《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》對大鼠進行處置，并按照4R原則給予人道關(guān)懷。

1.2.2 藥物與試劑 阿侖膦酸鈉片（商品名：福善美，規(guī)格：7 mg/粒，批號：20190611）購自杭州默沙東制藥有限公司；骨碎補總黃酮[商品名：強骨膠囊，規(guī)格：0.25 g/粒，其中有效成分（骨碎補總黃酮）約為0.18 g，批號：191011]購自北京岐黃制藥有限公司；LEP ELISA試劑盒（批號：E16036967）、ADP ELISA試劑盒（批號：D17036968）均購自武漢華美生物工程有限公司；雌二醇（E2）ELISA試劑盒（批號：501890）購自美國Cayman公司。

1.2.3 主要儀器H1650R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；PW-812型全自動酶標(biāo)洗板機（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；MB-530型多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；HNCDC/CZG-10-103型骨密度儀（美國Hologic Discovery）。

1.2.4 分組與造模 將大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、中藥組、西藥組，每組10只。造模參考文獻[5]，采用背側(cè)入路行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)以建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，10%水合氯醛（3 mL/kg）行腹腔麻醉，麻醉滿意后俯臥位固定大鼠，背側(cè)骶尾部至肋骨下緣備皮消毒，取背側(cè)肋緣下正中1.5 cm為中點做一長約1.5 cm縱行切口至皮下，牽拉切口左移1 cm垂直鈍性分離皮下肌肉組織顯露腹腔，可見大量白色脂肪組織，小心提拉探查脂肪組織，可見淡紅色桑葚狀卵巢組織及相連的輸卵管，3-0外科縫線環(huán)狀結(jié)扎卵巢與輸卵管連接處后，使用組織剪剪除卵巢，將剩余組織回納至腹腔并縫合肌肉組織，牽拉切口至中點右側(cè)1 cm，同前切除右側(cè)卵巢組織，逐層縫合術(shù)口，絡(luò)合碘二次消毒?？瞻捉M大鼠找到卵巢后，將卵巢從腹腔提出而不切除，僅切除周圍少量脂肪組織，術(shù)前0.5 h和術(shù)后3 d給予青霉素G鈉鹽5萬單位肌內(nèi)注射，預(yù)防感染。

1.2.5 實驗給藥 造模2個月后，造模組大鼠骨密度明顯低于對照組則提示骨質(zhì)疏松癥模型制備成功[5]，開始對各組大鼠灌胃給藥，給藥體積均為10 mL/kg。中藥組（骨碎補總黃酮）與西藥組（阿侖膦酸鈉）通過人與動物體表面積比值換算出等效用藥劑量，所用藥物以蒸餾水定容至所需濃度。中藥組按照25 mg/kg劑量灌胃給藥，1次/d；西藥組按照4 mg/kg劑量灌胃給藥，1次/周；對照組、模型組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水。連續(xù)灌胃12周。

1.2.6 觀察指標(biāo)

1.2.6.1 標(biāo)本采集 給藥12周后，最后一次灌胃2 h后腹腔麻醉，腹主動脈采血4 mL，3000 r/min離心15 min，分離血清后分裝至-80℃冰箱中保存；脫頸椎處死各組大鼠，完整分離出左側(cè)股骨，小心剔除肌肉組織后，放入-80℃冰箱中保存，備用。

1.2.6.2 BMD檢測 取出備用的股骨，仔細剔除附著的肌肉軟組織，生理鹽水沖洗，雙能X線骨密度儀測定各組大鼠離體左側(cè)股骨骨密度。

1.2.6.3 E2、LEP、ADP含量檢測ELISA法分別檢測各組大鼠血清中的E2、LEP、ADP含量，嚴格按試劑盒說明書要求進行操作。1.3統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 23.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，使用GraphPad Prism 7.0進行數(shù)據(jù)可視化呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 骨碎補總黃酮有效成分篩選 使用“骨碎補”作為關(guān)鍵詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得71種主要成分信息，使用ADME原則進行二次篩選后滿足OB值≥30%，DL值≥0.18的有效成分有18種，其中骨碎補黃酮類有效成分共10種。（見表1）

表1 骨碎補總黃酮有效成分信息表

2.2 分子對接結(jié)果及呈現(xiàn) 為進一步評價骨碎補總黃酮有效成分與ADP、LEP的親和能力，使用AutodockTools對篩選出的有效成分及目標(biāo)靶點進行分子對接計算，對接結(jié)果見表2。根據(jù)DENNIS等[6]研究報道，結(jié)合能≤-4.0 kcal/mol表明分子與靶點具有一定的結(jié)合活性，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol表明分子與靶點具有良好的結(jié)合活性，結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol表明分子與靶點具有明顯結(jié)合活性，故選用結(jié)合能≤-5.0kcal/mol作為結(jié)合有效指標(biāo)。結(jié)果顯示，骨碎補總黃酮與LEP結(jié)合能≤-5.0kcal/mol的有效成分有6種，占總數(shù)的60%；與LEP結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol的有效成分有8種，占總數(shù)的80%。采用Pymol2.4.0對有效成分與LEP、ADP對接結(jié)合能絕對值排名前三的結(jié)果進行可視化呈現(xiàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 有效成分與靶點蛋白對接結(jié)果可視化呈現(xiàn)

2.3 各組大鼠BMD比較 與空白組比較，模型組大鼠BMD明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠BMD明顯升高（P<0.05），且中藥組大鼠BMD與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠骨密度（BMD）比較（±s，n=10）

2.4 各組大鼠血清E2、ADP、LEP水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清E2、ADP、LEP水平均明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，西藥組大鼠血清E2、LEP水平均明顯升高（P<0.01），而西藥組大鼠血清ADP水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；中藥組大鼠血清E2水平明顯升高（P<0.01），ADP水平明顯降低（P<0.01），而中藥組大鼠血清LEP水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與西藥組比較，中藥組大鼠血清E2、LEP、ADP水平均明顯降低（P<0.01）。（見圖3）

圖3 各組大鼠血清E2、ADP、LEP水平比較（±s，n=10）

3 討論

中醫(yī)學(xué)認為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥屬“骨痿”范疇，病位位于腎、脾二臟。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生主要與腎虛和血瘀有關(guān)，其中腎虛是本病的主要原因。骨碎補是補腎藥的代表之一。骨碎補性溫，味苦，歸肝、腎經(jīng)，具有補腎、壯骨、強筋、活血的功能。骨碎補總黃酮為其主要成分。課題組前期研究[7-8]證實，骨碎補總黃酮可通過升高BMP-2、Bcl-2、IGF-1等細胞因子的表達，延緩失用性骨質(zhì)疏松癥模型大鼠BMD的降低。

成骨細胞與破骨細胞之間的動態(tài)平衡變化一直是研究骨組織新生修復(fù)、維持骨量的關(guān)鍵，兩種細胞分別來自BMSC及造血干細胞的分化[9]，同時BMSC也可以分化出脂肪細胞，隨之也伴隨著BMSC的成骨-成脂分化競爭機制。研究[10]顯示，脂肪細胞分泌的脂肪因子不僅可以參與調(diào)節(jié)成骨分化，還可以通過影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，參與破骨細胞分化的啟動、分化進程，提示脂肪因子很可能通過多種途徑參與成骨-破骨平衡的調(diào)節(jié)。ADP是由脂肪細胞分泌的一種特異性蛋白，在成骨、破骨細胞表面均檢測到其相應(yīng)的兩種受體ADP受體1和ADP受體2。而目前ADP對成骨細胞及破骨細胞增殖、分化、活性、功能的影響研究尚無統(tǒng)一定論，富集在骨骼局部的ADP和游離在外周血中的ADP對成骨、破骨細胞的影響也具有差異性[11]。早期研究發(fā)現(xiàn)ADP能通過影響OPG/RANK/RANKL信號通路的表達間接促進破骨細胞的分化及功能，同時能通過MAPK信號通路誘導(dǎo)成骨細胞的增殖和分化，影響成骨-破骨平衡的穩(wěn)定，最終導(dǎo)致骨量的流失[12]。有學(xué)者通過分析臨床觀察數(shù)據(jù)后提出血清ADP水平升高與骨密度成負相關(guān)，而降低ADP的表達對降低PMOP的發(fā)生率有著積極作用[13]。動物實驗研究[14]證實，通過ADP受體抑制劑干預(yù)的小鼠骨骼再生速度更快，而脂肪生成速度減緩；敲除ADP基因小鼠的骨密度升高，骨組織內(nèi)骨小梁數(shù)目增多，體內(nèi)破骨細胞數(shù)量減少[10]，這與本次研究的結(jié)果一致。而重組ADP對ADP缺乏模型小鼠進行干預(yù)后，RANKL/OPG比值降低，破骨細胞分化數(shù)量減少[15]，值得注意的是，局部ADP的升高可以抑制成骨細胞的分化，導(dǎo)致骨密度降低[16]。LEP是一種由167個氨基酸組成的分泌型蛋白質(zhì)，主要由白色脂肪組織產(chǎn)生。此外，骨髓中的脂肪組織也可以產(chǎn)生LEP。LEP是肥胖基因（Ob）的表達產(chǎn)物，在成骨、破骨細胞表面同樣可以檢測到其受體[17]。LEP可通過中樞和外周兩種途徑影響骨代謝：在外周，LEP一方面抑制脂肪細胞的形成并促進成骨細胞的分化，另一方面通過激活OPG/RANK/RANKL信號通路升高骨保護素（Osteoprotegerin，OPG）含量，進而抑制破骨細胞的產(chǎn)生，最終對成骨-破骨平衡起到正向調(diào)節(jié)作用；在中樞，LEP通過興奮交感神經(jīng)、促進去甲腎上腺素的釋放、增加RANKL的表達來促進破骨細胞的增殖分化，最終達到抑制骨形成的作用[18-21]。LIU X L等[22]在追趕生長（Catch-up growth，CUG）模型動物實驗中觀察到高脂飲食導(dǎo)致了骨量的嚴重減少，LEP的不足更是加重了骨量的丟失，且骨組織形態(tài)學(xué)上發(fā)生了嚴重病理變化。

分子對接計算結(jié)果顯示，骨碎補總黃酮中部分成分可以與ADP、LEP進行對接，且與ADP的結(jié)合活性相對較好。其中骨碎補苷A（Davallioside A_qt）與ADP結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol，表明這一成分很可能是骨碎補總黃酮與ADP作用的主要成分。動物實驗中，經(jīng)骨碎補總黃酮與阿侖膦酸鈉片干預(yù)的去勢大鼠BMD及E2的表達均高于模型組，但在對ADP和LEP的作用上表現(xiàn)出相反的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，多種補腎中藥復(fù)方可以通過抑制LEP啟動子的甲基化從而提高LEP的表達量以防治OP[23]，但在本次研究中并未觀察到LEP含量的上升，這可能與LEP主要在成骨細胞礦化期分泌合成而在成骨細胞成熟后消失有關(guān)[24]。本次分子對接結(jié)果及動物實驗結(jié)果顯示，在PMOP疾病進程中，大鼠血清ADP、LEP水平均明顯降低；骨碎補總黃酮可能通過改善E2分泌、降低ADP的表達，延緩BMD的流失來防治PMOP，但相關(guān)的機制仍需進一步進行探究。