蘇 梅，婁雅靜，王 姍，李雙利，秦引林

（1.江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司，江蘇 南京 210016；2.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210009）

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病患者中首要的并發(fā)癥，也是最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是一種由視網(wǎng)膜缺血、炎癥、新生血管異常導(dǎo)致的眼底病變[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球大約有超過2.8億人存在視力損害和失明，如白內(nèi)障、青光眼、老年性黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變等，研究認(rèn)為長(zhǎng)期高血糖是該類疾病的主要病因之一[2]。

根據(jù)疾病進(jìn)展DR可分為早期的非增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變（NPDR）和晚期的增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變（PDR）兩個(gè)階段。當(dāng)NPDR發(fā)展為PDR階段，本病可以引起視力下降甚至失明[3]。在NPDR期，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）和一氧化氮（NO）水平均升高。CTGF濃度與玻璃體視網(wǎng)膜纖維化之間的正相關(guān)程度證實(shí)了CTGF參與并促進(jìn)了纖維血管膜的形成[4]；CTGF水平降低，對(duì)功能性血管網(wǎng)絡(luò)的建立無影響[5]。即使疾病進(jìn)一步發(fā)展為PDR，靶向的CTGF治療也可以降低臨床給予抗VEGF藥后導(dǎo)致的CTGF水平升高，降低纖維化和牽引性視網(wǎng)膜脫離的風(fēng)險(xiǎn)[6]。在視網(wǎng)膜中NO通過參與光轉(zhuǎn)導(dǎo)過程起維持正常視覺功能的作用，在正常情況下NO可參與視網(wǎng)膜血流控制和介導(dǎo)乙酰膽堿、緩激肽等物質(zhì)引起的血管擴(kuò)張反應(yīng)。在DR中，NO通過抑制視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞的增殖，減少視桿細(xì)胞外節(jié)的吞噬作用，進(jìn)一步影響視網(wǎng)膜中的神經(jīng)元和感光細(xì)胞[7]?？刂芅O水平可有效預(yù)防DR的嚴(yán)重程度增加[8-9]。此外，隨著病情加重，DR患者玻璃體或房水中的炎癥因子水平上升。這些炎性介質(zhì)的積累會(huì)造成視網(wǎng)膜早期神經(jīng)元細(xì)胞的死亡[10]。

近年來，中醫(yī)藥治療已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，但臨床治療DR的中成藥卻不多。腦脈利顆粒由益母草、三七、黃芪、姜黃、川芎、紅花、丹參、赤芍、當(dāng)歸、白芍、川牛膝等制成，具有抗炎、促進(jìn)血管新生作用[11]。基于此，本研究采用高濃度葡萄糖作為誘導(dǎo)因子，模擬視網(wǎng)膜病變的產(chǎn)生與病變過程對(duì)斑馬魚的形態(tài)、視網(wǎng)膜微血管病變、炎癥的影響，并對(duì)NO和CTGF水平進(jìn)行檢測(cè)，以探究腦脈利顆粒是否能夠治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變，旨在為臨床上治療DR提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 受精后3 dpf[12]野生型AB品系斑馬魚來自國家斑馬魚資源中心，南京睿鷹潤(rùn)澤生物醫(yī)藥科技有限公司構(gòu)建轉(zhuǎn)基因型血管內(nèi)皮細(xì)胞增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記（flil：EGFP）品系斑馬魚和轉(zhuǎn)基因型中性粒細(xì)胞增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記（mpx：EGFP）品系斑馬魚，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2018-0019。斑馬魚飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS/cm；pH值為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3）。

按照《The Zebrafish Book》中方法飼養(yǎng)斑馬魚，保持循環(huán)系統(tǒng)水溫為28.5℃，每天固定光照時(shí)間為14 h，早晚飼喂豐年蝦（天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司生產(chǎn)）各一次。收集胚胎前一天晚上將斑馬魚雌魚、雄魚放置于產(chǎn)卵缸中，以隔板將雌雄隔開，按照正常飼養(yǎng)光照時(shí)間，22:30:00關(guān)燈，次日08:30:00光照刺激并抽離隔板使雌雄接觸。30 min后收集胚胎并用egg water清洗后，飼養(yǎng)于28.5℃的光照培養(yǎng)箱中。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-11-015），符合3R原則。

1.2 藥物與試劑 腦脈利顆粒（批號(hào)：11-191010）購自南京柯菲平盛輝制藥有限公司，母液用超純水配制成250 mg/mL，再用egg water配制成工作液。復(fù)方血栓通膠囊（批號(hào)：181109）購自廣東眾生藥業(yè)股份有限公司，母液用超純水配制成9.6mg/mL，再用egg water配制成工作液。甲基纖維素（批號(hào)：20180110）、三卡因（批號(hào)：WXBD1416V）均購自南京化學(xué)試劑一廠；葡萄糖測(cè)定試劑盒（批號(hào)：WXEVE8YAXX）、NO測(cè)定試劑盒（批號(hào)：NHXGET5A9Q）均購自Elabscience；Trizol（批號(hào)：L/N7E403L0）購自南京諾唯贊生物試劑有限公司；SYBR Green real time PCR試劑盒（批號(hào)：A5502-1）購自Takara。

1.3 主要儀器Pax-250B型智能光照培養(yǎng)箱（寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SZX16型斑馬魚體視鏡（Olympus）；XW-80A型旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；BSA224S型電子天平（美國Sartourius公司）；Research plus型移液器（德國Eppendorf公司）；SCIENT2-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SYNERGY/HT型多功能酶標(biāo)儀（Biotek）；StepOnePlus型實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x（Applied Biosystems）。

1.4 造模與分組 野生型AB品系斑馬魚胚胎（3 dpf）、轉(zhuǎn)基因型血管內(nèi)皮細(xì)胞增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記（flil：EGFP）品系斑馬魚胚胎（3 dpf）、轉(zhuǎn)基因型中性粒細(xì)胞增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記（mpx：EGFP）品系斑馬魚胚胎（3 dpf），放置在6孔板中（每孔30個(gè)胚胎），每孔5 mL工作液，工作液中含有130 mmol/L的葡萄糖，維持培養(yǎng)3 d[12]，以斑馬魚體內(nèi)血糖濃度升高、視網(wǎng)膜血管直徑增加、體內(nèi)NO和CTGF水平升高、炎癥水平升高為判斷模型成功的標(biāo)準(zhǔn)[12]。不做任何處理、正常飼喂的斑馬魚作為對(duì)照組，高糖處理造模的斑馬魚隨機(jī)分為模型組、復(fù)方血栓通膠囊低劑量組、復(fù)方血栓通膠囊高劑量組、腦脈利顆粒低劑量組、腦脈利顆粒中劑量組、腦脈利顆粒高劑量組。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 將復(fù)方血栓通膠囊低、高劑量組斑馬魚分別暴露于低、高濃度復(fù)方血栓通膠囊溶液（7.6、76 μg/mL）中，腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚分別暴露于低、中、高濃度腦脈利顆粒溶液（50、100、250 μg/mL）中，3 dpf時(shí)開始進(jìn)行給藥處理，6 dpf時(shí)結(jié)束給藥。對(duì)照組及模型組斑馬魚不進(jìn)行給藥處理。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 斑馬魚存活率檢測(cè) 將轉(zhuǎn)基因型（flil：EGFP）斑馬魚胚胎（3 dpf）放置在6孔板中（每孔30個(gè)胚胎），每孔5 mL工作液，模型組及各給藥組工作液中含有130 mmol/L的葡萄糖和相應(yīng)濃度的藥物。維持培養(yǎng)3 d后，6 dpf時(shí)統(tǒng)計(jì)致畸率及存活率。實(shí)驗(yàn)進(jìn)程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

1.6.2 葡萄糖水平的檢測(cè) 用葡萄糖測(cè)定試劑盒對(duì)斑馬魚的全身裂解物進(jìn)行葡萄糖水平的定量分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中取30尾斑馬魚幼魚，置于500 μL的去離子水中在冰上進(jìn)行超聲處理。用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。加入總量為2 mL的測(cè)定試劑，37℃孵育30 min。用配備gen5軟件的BioTek讀板儀測(cè)量540 nm處的熒光，檢測(cè)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)的葡萄糖水平。

1.6.3 斑馬魚眼睛大小的觀察 斑馬魚胚胎生長(zhǎng)至6 dpf后，用三卡因溶液麻醉并固定后，用體視顯微鏡拍照，用Image J軟件測(cè)量斑馬魚眼睛和身體長(zhǎng)度。體長(zhǎng)為從頭部頂端到軀干末端（不包括尾鰭），眼睛長(zhǎng)度為眼睛長(zhǎng)軸前部至后部。同時(shí)，測(cè)量斑馬魚眼睛和身體面積，計(jì)算眼睛長(zhǎng)度和身體長(zhǎng)度的比值，以及眼睛面積和身體面積的比值。

1.6.4 玻璃體-視網(wǎng)膜血管直徑的測(cè)量6 dpf時(shí)，4% PFA固定斑馬魚幼魚，4℃過夜。用蒸餾水（1.5 mL/孔）洗滌3次，20 min/次，然后用含3%胰蛋白酶的Tris-HCl緩沖液（pH值為7.8）37℃孵育80 min后，分離出含有玻璃樣視網(wǎng)膜血管的晶狀體。使用Olympus體視顯微鏡。

1.6.5 中性粒細(xì)胞數(shù)量檢測(cè) 用轉(zhuǎn)基因型（mpx：EGFP）斑馬魚構(gòu)建高葡萄糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷模型。在3 dpf時(shí)進(jìn)行給藥處理；在6 dpf時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚血管中綠色顆粒狀的中性粒細(xì)胞數(shù)量來反應(yīng)炎癥程度。

1.6.6 qPCR法檢測(cè)斑馬魚CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA水平 在6 dpf時(shí)，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中取30尾斑馬魚幼魚，置于500 μL的去離子水中于冰上進(jìn)行超聲處理，使用Trizol試劑提取樣品的總RNA，用PrimeScriptRTMaster Mix將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA作為模板應(yīng)用于Thermal Cycler DiceRReal Time System進(jìn)行定量PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列信息

1.6.7 斑馬魚全身裂解物NO水平 用NO測(cè)定試劑盒對(duì)斑馬魚的全身裂解物進(jìn)行NO水平的定量分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中取30尾斑馬魚幼魚，置于500 μL的去離子水中于冰上進(jìn)行超聲處理。NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成NO2-，與顯色劑生成淡紅色偶氮化合物，生成偶氮化合物的濃度與NO的濃度具有線性關(guān)系，通過比色可以計(jì)算NO的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，origin8.0處理圖片，計(jì)量資料采用（±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較（多重比較）采用Dunnett's multiple comparisons test，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高葡萄糖對(duì)斑馬魚正常發(fā)育的影響

2.1.1 各組斑馬魚存活率比較 對(duì)照組斑馬魚未見死亡。與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚胚胎的存活率明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊低劑量組斑馬魚胚胎的存活率明顯升高（P<0.01）；復(fù)方血栓通膠囊高劑量組斑馬魚胚胎的存活率與模型相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚胚胎的存活率均明顯升高（P<0.01），且隨著腦脈利顆粒劑量的增加，斑馬魚胚胎的存活率逐漸降低（P<0.05）。（見表2）

表2 各組斑馬魚存活率比較（±s）

表2 各組斑馬魚存活率比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與復(fù)方血栓通膠囊低劑量組比較，cP<0.05；與復(fù)方血栓通膠囊高劑量組比較，dP<0.05；與腦脈利顆粒低劑量組比較，eP<0.05；與腦脈利顆粒中劑量組比較，fP<0.05

組別 胚胎數(shù)（個(gè)） 給藥劑量（μg/mL） 存活率（%）對(duì)照組 30 - 100.00±2.00模型組 30 - 83.33±3.72a復(fù)方血栓通膠囊低劑量組30 7.6 100.00±1.77b復(fù)方血栓通膠囊高劑量組30 76.0 80.00±5.00c腦脈利顆粒低劑量組 30 50.0 100.00±1.00b d腦脈利顆粒中劑量組 30 100.0 96.00±1.00b c d e腦脈利顆粒高劑量組 30 250.0 93.00±3.00b c d e f F 257.000 P 0.000

2.1.2 各組斑馬魚形態(tài)比較7組斑馬魚胚胎形態(tài)大小正常，未見胚胎畸形。（見圖2）

圖2 各組斑馬魚形態(tài)比較（×4）

2.2 腦脈利顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)的斑馬魚血糖的影響 與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚體內(nèi)血糖明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊低、高劑量組和腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚體內(nèi)血糖均明顯降低（P＜0.05），且均具有劑量依賴性；復(fù)方血栓通膠囊低、高劑量組斑馬魚體內(nèi)血糖均低于腦脈利顆粒低、中、高劑量組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組斑馬魚體內(nèi)血糖比較（±s）

表3 各組斑馬魚體內(nèi)血糖比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05；與復(fù)方血栓通膠囊低劑量組比較，cP＜0.05；與復(fù)方血栓通膠囊高劑量組比較，dP＜0.05；與腦脈利顆粒低劑量組比較，eP＜0.01；與腦脈利顆粒中劑量組比較，fP＜0.01

組別 胚胎數(shù)（個(gè)） 給藥劑量（μg/mL） 血糖（mmol/L）對(duì)照組 30 - 28.41±4.99模型組 30 - 454.55±10.01a復(fù)方血栓通膠囊低劑量組30 7.6 217.67±11.04b復(fù)方血栓通膠囊高劑量組30 76.0 170.45±14.96bc腦脈利顆粒低劑量組 30 50.0 426.14±12.92bcd腦脈利顆粒中劑量組 30 100.0 303.03±12.69bcde腦脈利顆粒高劑量組 30 250.0 274.62±15.67bcdef F 4375.000 P 0.000

2.3 腦脈利顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)的斑馬魚眼睛發(fā)育的影響7組斑馬魚眼睛長(zhǎng)度/身體長(zhǎng)度比值和眼睛面積/身體面積比值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖3～4）

圖3 各組斑馬魚眼睛長(zhǎng)度/身體長(zhǎng)度的比值比較（±s，n=30）

圖4 各組斑馬魚眼睛面積/身體面積的比值比較（±s，n=30）

2.4 腦脈利顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)的斑馬魚玻璃體-視網(wǎng)膜血管直徑的影響 與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚視網(wǎng)膜血管直徑明顯增大（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊低、高劑量組和腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚視網(wǎng)膜血管直徑均明顯減?。≒＜0.05），且均具有劑量依賴性；復(fù)方血栓通膠囊低、高劑量組斑馬魚視網(wǎng)膜血管直徑均明顯小于腦脈利顆粒低、中、高劑量組（P＜0.05）。（見圖5～6）

圖5 各組斑馬魚玻璃樣視網(wǎng)膜血管圖（×200，標(biāo)尺：25 μm）

圖6 各組斑馬魚視網(wǎng)膜血管直徑比較（±s，n=30）

2.5 腦脈利顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)炎癥的影響

2.5.1 各組斑馬魚血管中中性粒細(xì)胞數(shù)量比較 對(duì)照組斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量正常；與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚血管中中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯增多；與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊低、高劑量組和腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚血管中中性粒細(xì)胞數(shù)量均明顯減少。（見圖7）

圖7 各組斑馬魚血管中中性粒細(xì)胞數(shù)量比較（×8）

2.5.2 各組斑馬魚體內(nèi)CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA水平比較 與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚體內(nèi)IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、CTGF mRNA水平均明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊低、高劑量組和腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚體內(nèi)IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、CTGF mRNA水平均明顯降低（P<0.05），且均具有劑量依賴性；腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚體內(nèi)IL-1β mRNA水平均高于復(fù)方血栓通膠囊高劑量組（P<0.05）；復(fù)方血栓通膠囊高劑量組斑馬魚體內(nèi)IL-6 mRNA水平與腦脈利顆粒高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；復(fù)方血栓通膠囊低、高劑量組斑馬魚體內(nèi)TNF-α mRNA、CTGF mRNA水平均高于腦脈利顆粒高劑量組（P<0.05）。（見表4）

表4 各組斑馬魚體內(nèi)CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA水平比較（±s）

表4 各組斑馬魚體內(nèi)CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05；與復(fù)方血栓通膠囊低劑量組比較，cP<0.05；與復(fù)方血栓通膠囊高劑量組比較，dP<0.05；與腦脈利顆粒低劑量組比較，eP<0.01；與腦脈利顆粒中劑量組比較，fP<0.01

組別 胚胎數(shù)（個(gè)）給藥劑量（μg/mL）IL-1β mRNA IL-6 mRNA TNF-α mRNA CTGF mRNA對(duì)照組 30 - 1.01±0.48 1.01±0.02 1.00±0.03 1.01±0.001模型組 30 - 10.88±0.27a 8.45±0.50a 9.88±0.17a 2.78±0.04a復(fù)方血栓通膠囊低劑量組 30 7.6 7.86±0.33b 4.89±0.33b 7.31±0.22b 2.29±0.03b復(fù)方血栓通膠囊高劑量組 30 76.0 3.68±0.41b c 3.87±0.60b c 5.13±0.17b c 1.63±0.02b c腦脈利顆粒低劑量組 30 50.0 10.36±0.47b c d 6.94±0.64b c d 8.67±0.24b c d 2.42±0.03b c d腦脈利顆粒中劑量組 30 100.0 6.77±0.45b c d e 5.39±0.49b c d e 5.67±0.32b c d e 2.33±0.05b c d e腦脈利顆粒高劑量組 30 250.0 4.62±0.34b c d e f 4.01±0.33b c d e f 2.71±0.28b c d e f 1.28±0.10b c d e f F 2408.000 808.500 6062.000 5425.000 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.6 各組斑馬魚體內(nèi)NO水平比較 與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚體內(nèi)NO水平明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊低、高劑量組和腦脈利顆粒低、中、高劑量組斑馬魚體內(nèi)NO水平均明顯降低（P<0.05），且具有劑量依賴性；復(fù)方血栓通膠囊高劑量組斑馬魚體內(nèi)NO水平與腦脈利顆粒高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見表5）

表5 各組斑馬魚體內(nèi)NO水平比較（±s）

表5 各組斑馬魚體內(nèi)NO水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05；與復(fù)方血栓通膠囊低劑量組比較，cP<0.05；與復(fù)方血栓通膠囊高劑量組比較，dP<0.05；與腦脈利顆粒低劑量組比較，eP<0.01；與腦脈利顆粒中劑量組比較，fP<0.01

組別 胚胎數(shù)（個(gè)）給藥劑量（μg/mL）NO（pmol/mg）對(duì)照組 30 - 30.24±3.15模型組 30 - 70.25±4.27a復(fù)方血栓通膠囊低劑量組30 7.6 45.30±4.30b復(fù)方血栓通膠囊高劑量組30 76.0 39.61±6.44b c腦脈利顆粒低劑量組 30 50.0 56.73±3.87b c d腦脈利顆粒中劑量組 30 100.0 42.50±5.26b e腦脈利顆粒高劑量組 30 250.0 38.27±4.58b c e f F 246.200 P 0.000

3 討論

斑馬魚作為常用的模式生物，與哺乳動(dòng)物的遺傳和生理極為相似，且產(chǎn)卵量大，養(yǎng)殖簡(jiǎn)單，發(fā)育時(shí)間短，72 hpf就具備視覺功能，能夠有效提高實(shí)驗(yàn)效率[12]。本實(shí)驗(yàn)采用高葡萄糖造模。與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚血糖明顯升高、視網(wǎng)膜血管直徑明顯增大，且出現(xiàn)了多項(xiàng)DR關(guān)鍵指標(biāo)如中性粒細(xì)胞、CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、NO的異常，表明造模成功。

DR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但疾病進(jìn)展離不開視網(wǎng)膜中的炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DR屬本虛標(biāo)實(shí)之證，氣陰血虛以致血行不暢、脈絡(luò)阻滯[14]。NO和CTGF水平對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展也有極大的影響。NO水平升高，不僅會(huì)影響視網(wǎng)膜中的神經(jīng)元和感光細(xì)胞，還參與氧化/硝化應(yīng)激反應(yīng)，增加糖尿病性視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度[7]。臨床研究表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度與血清中NO水平呈正相關(guān)[15]。CTGF不僅參與促進(jìn)纖維血管膜的形成，還可以分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底層增厚[4]，增加糖尿病引起的周細(xì)胞丟失[16]。

目前針對(duì)DR的治療手段有限，主要有抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物治療、抗炎治療、手術(shù)治療、激光光凝治療等手段，但這些治療手段存在一些弊端，比如抗VEGF藥物作為治療增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）的一線藥物，因半衰期短，需要頻繁注射，患者依從性差，且頻繁注射使眼內(nèi)炎的發(fā)病率增加[17]；單純應(yīng)用全視網(wǎng)膜光凝治療嚴(yán)重非增殖性和增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變有一定的療效，但效果不明顯[18]，而一些中成藥在防治DR上發(fā)揮了積極作用[19]。由多味傳統(tǒng)中藥通過現(xiàn)代化技術(shù)制成的腦脈利顆粒，具有益氣通脈、活血化瘀的功效，且具有毒副作用小、患者用藥依從性高的特點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，腦脈利顆粒能夠有效降低糖尿病性視網(wǎng)膜病變斑馬魚模型體內(nèi)的血糖濃度，減小視網(wǎng)膜微血管直徑，減輕炎癥反應(yīng)，降低IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)水平，降低體內(nèi)CTGF和NO水平，提示腦脈利顆粒對(duì)DR具有一定的改善作用。陽性對(duì)照藥物復(fù)方血栓通膠囊主要由三七、黃芪、玄參、丹參組成，在單獨(dú)使用或者聯(lián)合其他治療手段治療糖尿性病視網(wǎng)膜病變方面具有良好的效果[20-21]。據(jù)報(bào)道，三七的有效成分三七皂苷R1不僅具有良好的抗氧化應(yīng)激作用，還具有明顯的抗DR療效[22]。腦脈利顆粒中含有三七、黃芪、丹參、益母草、姜黃、當(dāng)歸、川牛膝等中藥，具有良好的補(bǔ)氣活血的功效，且腦脈利顆粒具有抗炎、抗氧化應(yīng)激作用[23-24]。本研究表明，在降低斑馬魚 體內(nèi)CTGF mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA和NO水平方面，腦脈利顆粒與復(fù)方血栓通膠囊療效基本相當(dāng)，但腦脈利顆粒還可以有效控制血糖濃度升高，延緩DR疾病發(fā)展，說明腦脈利顆粒治療該類疾病具有一定可行性。

本研究通過高濃度葡萄糖誘導(dǎo)斑馬魚視網(wǎng)膜病變模型驗(yàn)證了腦脈利顆粒能夠降低血糖濃度，并改善其引起的視網(wǎng)膜病變。此外，腦脈利顆粒還可能通過調(diào)控炎癥因子、NO和CTGF水平來抑制DR的進(jìn)展，提示腦脈利顆粒對(duì)高葡萄糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變具有一定防治作用。本研究結(jié)果為該藥用于糖尿病性視網(wǎng)膜病變的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)增加了對(duì)DR疾病發(fā)展的預(yù)防性藥物以及PDR期輔助治療藥物的選擇，拓展了糖尿病性視網(wǎng)膜病變治療藥物的研究方向。