張馨怡，劉文濤，李利娟，柴冰茹，徐梟喻，白生賓

新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，新疆烏魯木齊 830000

地方性氟中毒是我國“十四五”期間地方病學(xué)優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域之一，有研究顯示部分地區(qū)地表水氟含量超標(biāo)，并呈現(xiàn)季節(jié)性變化。截至2020 年底，我國僅飲水型地方性氟中毒病區(qū)縣達1 041個，病區(qū)村更高達7 萬余個，數(shù)十萬兒童患氟斑牙、氟骨癥[1-2]。骨穩(wěn)態(tài)依賴于破骨細(xì)胞對骨的吸收和成骨細(xì)胞的骨形成作用，并達到動態(tài)平衡。這種緊密耦合過程的失衡會破壞骨形成-骨吸收穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等骨溶解性疾病。適量氟可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化或抑制破骨細(xì)胞功能從而促進成骨，使骨質(zhì)增多，促進鈣沉積，而過量氟可促進破骨細(xì)胞骨過度吸收導(dǎo)致脆性骨折等疾病。因此，研究影響破骨細(xì)胞骨吸收相關(guān)因素對骨溶解性疾病的治療至關(guān)重要。一定量的氟可影響破骨細(xì)胞的生成和活化，破骨細(xì)胞活化后的骨吸收過程又與自噬密切相關(guān)，自噬是細(xì)胞物質(zhì)被溶酶體或液泡降解并循環(huán)利用的過程，但自噬在適量氟影響破骨細(xì)胞骨吸收過程中的作用機制尚未闡明。本研究以RAW264.7 細(xì)胞誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞為研究對象，氟化鈉、自噬抑制劑氯喹、自噬激動劑雷帕霉素干預(yù)后，分析AKT/mTOR/ULKl信號通路在氟離子調(diào)控破骨細(xì)胞自噬中的可能作用機制，探究氟對骨吸收產(chǎn)生的影響，一方面探索一定劑量的氟是否能作為骨保護因素抑制骨吸收，一方面為慢性氟中毒的公共預(yù)防和治療提供更充分有效的理論依據(jù)。

材料與方法

1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 采用RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞和配套專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)，磷酸鹽緩沖液(美國GIBCO 公司)，氟化鈉(NaF；天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，自噬抑制劑氯喹(CQ；美國MedChemExpress 公司)，自噬激動劑TTNPB(RAP；美國MedChemExpress 公司)，p-AKT(瑞士Bioss 公司)，p-mTOR(瑞士Bioss 公司)，p-ULK1(瑞士Bioss 公司)，SYBR Green PCR 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)，SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒(Biosharp 公司)，Rb anti-beta-Actin(瑞士Bioss 公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國精騏)，倒置生物顯微鏡系統(tǒng)(寧波舜宇儀器有限公司)，熒光顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(北京凱奧公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)，梯度PCR 儀(美國伯樂公司)，超微量分光光度計(北京凱奧公司)。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 本實驗分為破骨細(xì)胞(Control)組、破骨細(xì)胞+氟(NaF) 組、破骨細(xì)胞+CQ(CQ)組、破骨細(xì)胞+CQ+氟(CQ+NaF) 組、破骨細(xì)胞+RAP(RAP)組、破骨細(xì)胞+RAP+氟(RAP+NaF)組。將誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞培養(yǎng)于專用高糖DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞輕輕拍打培養(yǎng)瓶底將細(xì)胞拍打下來，用移液槍吹打混勻，轉(zhuǎn)移至15 mL 的離心管中，室溫下1 000 r/min 離心5 min，棄去上清，加入1 mL 完全培養(yǎng)基重懸，輕輕吸至24 孔板中，每孔加500 mL 培養(yǎng)基，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

3 激光共聚焦顯微鏡檢測自噬小體 采用激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿，加入細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱中靜置24 h，等待細(xì)胞貼壁取對數(shù)生長期細(xì)胞根據(jù)分組進行刺激。課題組前期研究結(jié)果顯示氟化鈉10 mg/L 刺激24 h 為最佳刺激濃度和時間，因此NaF 組給予氟化鈉10 mg/L 刺激，24 h后進行檢測；CQ 組給予自噬抑制劑CQ 5 mmol/L；CQ+NaF 組給予10 mg/L NaF、5 mmol/L CQ 刺激24 h；RAP 組給予自噬激動劑RAP 5 mmol/L；RAP+NaF 組給予10 mg/L NaF、5 mmol/L RAP刺激24 h。吸出培養(yǎng)基，PBS 清洗3 遍，每次3 min。2% 多聚甲醛溶液固定20 min，吸出固定液，PBS 清洗3 遍，每次3 min。加入0.1% Triton X-100 進行細(xì)胞透化，15 min 后，吸出液體，用PBS 清洗3 遍，每次3 min。加入BSA 封閉20 min，去除BSA，用PBS 清洗3 遍，每次3 min，加入一抗p-AKT 抗體4℃孵育過夜。吸出一抗，用PBS 清洗3 遍，每次3 min，加入熒光二抗37 ℃孵育1 h，用PBS 清洗3 遍，每次3 min，加入DAPI 細(xì)胞核襯染10 min，用PBS 清洗3 遍，每次3 min，上機鏡檢。熒光二抗為紅色熒光566 nm，DAPI 為藍(lán)色熒光359 nm，采圖。

4 熒光定量PCR 檢測各組細(xì)胞Cathepsin K 和TRAP 的基因表達水平 吸凈培養(yǎng)液，收集細(xì)胞采用Trizol 法提取mRNA，用RNase-Free 的水溶解RNA 沉淀，濃度測定。逆轉(zhuǎn)錄cDNA 共20 μL體系：RNA 5 μL；Random Primer 1 μL；Waternuclease-free 6 μL ；5 × Reaction Buffer 4 μL；RiboLock RNase Inhibitor 1 μL；10 mmol/L dNTP Mix 2 μL；RevertAid M-MuLV RT 1 μL。程序設(shè)定42℃變性60 min；25℃退火5 min；70℃延伸5 s，-80℃保存。熒光定量PCR 檢測各組骨吸收基因Cathepsin K 和TRAP 的基因表達水平，共20 μL 體系：SYBR? Select Master Mix 10 μL；上下游引物分別0.5 μL；模板2 μL；ddH2O 7 μL。程序設(shè)定94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火30 s，45 個循環(huán)；4℃保存。見表1。

表1 Cathepsin K 與TRAP 引物序列Tab.1 Cathepsin K and TRAP primer sequence

5 Western blotting 檢測各組細(xì)胞中p-AKT、pmTOR、p-ULK1 蛋白表達水平 定量后的蛋白采用SDS-PAGE 分離，用45μm 孔徑PVDF 膜濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。p-AKT、p-mTOR、p-ULK1一抗室溫孵育10 min，4℃過夜，TBST 洗膜3 次后加入Goat anti-rabbit lgG/HRP 二抗室溫孵育1 h。用TBST 洗膜3 次，每次10 min。ECL 加到膜上后反應(yīng)3～ 5 min，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)自動曝光，保存圖片。

6 統(tǒng)計學(xué)方法 本實驗采用Image J 制圖。各組之間比較采用GraphPad Prism 8.3.0 軟件包進行單因素方差分析并制圖。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 激光共聚焦顯微鏡示自噬小體 紅色熒光示自噬小體，藍(lán)色熒光示細(xì)胞核。與Control 組相比，NaF 組、RAP 組、RAP+NaF 組明顯促進自噬小體的產(chǎn)生(P＜0.05)，CQ 組明顯抑制自噬小體的產(chǎn)生(P＜0.05)。見圖1、圖2。

圖1 激光共聚焦顯微鏡示自噬小體 A：Control 組；B：NaF組；C：CQ 組；D：CQ+NaF 組；E：RAP 組；F：RAP+NaF 組Fig.1 Laser confocal microscopic examination of autophagy bodies A: Control group;B: NaF group;C: CQ group;D: CQ+NaF group;E: RAP group;F: RAP+NaF group

圖2 自噬小體數(shù)量(aP＜0.05,bP＜0.01,vs Control)Fig.2 Number of autophagosomes (aP＜0.05,bP＜0.01,vs Control)

2 熒光定量PCR 檢測各組骨吸收基因Cathepsin K 和TRAP 的基因表達水平 與Control 組相比，Cathepsin K 基因在NaF 組、CQ 組、CQ+NaF組、RAP+NaF 組中表達量均明顯降低；TRAP基因在NaF 組、CQ+NaF 組、RAP+NaF 組中表達量均明顯降低，在RAP 組中表達量明顯升高。見圖3。

圖3 各組Cathepsin K 與TRAP 基因的表達量(aP＜0.05,bP＜0.01,vs Control)Fig.3 Expression levels of Cathepsin K and TRAP genes in each group (aP＜0.05,bP＜0.01,vs Control)

3 Western blotting 檢測各組細(xì)胞中p-AKT、pmTOR、p-ULK1 蛋白表達水平 與Control 組相比，p-AKT 在NaF 組(P＜0.05)、CQ+NaF 組(P＜0.05)、RAP 組(P＜0.01)、RAP+NaF 組(P＜0.01) 中蛋白表達量上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與Control 組相比，p-mTOR 在NaF 組(P＜0.01)、CQ+NaF 組(P＜0.05)、RAP 組(P＜0.01)、RAP+NaF 組(P＜0.01)中蛋白表達量上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與Control 組相比，p-ULK1 在RAP 組(P＜0.01)、RAP+NaF 組(P＜0.01) 中蛋白表達量上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4、圖5。

圖4 各組細(xì)胞中p-AKT、p-mTOR、p-ULK1 蛋白表達量Fig.4 Protein expression levels of p-AKT,p-mTOR and p-ULK1 in cells of each group

圖5 各組細(xì)胞中p-AKT(A)、p-mTOR(B)、p-ULK1(C)蛋白表達水平(aP＜0.05,bP＜0.01,vs Control)Fig.5 Protein expression levels of p-AKT (A),p-mTOR (B) and p-ULK1 (C) in cells of each group (aP＜0.05,bP＜0.01,vs Control)

討 論

氟作為人體必需的微量元素，對青少年骨骼和牙齒的發(fā)育尤為重要，2.6 g 氟能夠維持成年人身體健康，但攝入過量會造成體內(nèi)氟蓄積，引起氟中毒。氟中毒是一種世界性地方病，我國地方性氟中毒主要為飲水型、燃煤污染型和飲茶型。氟對骨親和力很強，過量氟導(dǎo)致的氟骨病分為骨質(zhì)疏松型、骨軟化癥和骨硬化型，當(dāng)前研究的熱點集中在氟對骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的激活或抑制作用，但骨相關(guān)疾病中一定劑量氟如何對破骨細(xì)胞產(chǎn)生作用導(dǎo)致骨吸收或抑制骨吸收仍未有明確定論。

本研究發(fā)現(xiàn)10 mg/L 氟能夠促進自噬小體的形成從而增強自噬。當(dāng)細(xì)胞受到氟刺激時，自噬是選擇性清除受損細(xì)胞器以實現(xiàn)細(xì)胞成分循環(huán)的一種方式，其中自噬小體形成是一個受調(diào)控的膜重塑過程，涉及自噬體膜前體的產(chǎn)生、自噬體膜前體的組裝-形成吞噬體、吞噬體的伸長-完成自噬小體的形成。自噬小體的運輸及其與溶酶體的融合是完成自噬成熟和降解的重要步驟[3]。

自噬一定程度上可維持正常骨代謝，但自噬水平過高則引起骨相關(guān)細(xì)胞凋亡，加劇骨吸收，造成溶骨性疾病。破骨細(xì)胞通過分泌鹽酸和蛋白水解酶，包括Cathepsin K 和TRAP，溶解礦物質(zhì)和降解有機成分，并廣泛存在于破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩內(nèi)[4-6]。Cathepsin K 是一種參與骨吸收的溶酶體半胱氨酸蛋白酶，主要作用機制是其可以切割占骨有機基質(zhì)90%以上的1 型膠原的螺旋和末端肽區(qū)域從而致溶骨。TRAP 也被稱為紫色酸性磷酸酶，50 多年來一直是破骨細(xì)胞和骨吸收的確定標(biāo)志物，能夠脫磷酸化骨基質(zhì)蛋白，如骨橋蛋白、整合素結(jié)合唾液蛋白等，并產(chǎn)生活性氧以降解骨基質(zhì)，與骨密度呈負(fù)相關(guān)。本研究顯示自噬抑制劑CQ 降低破骨細(xì)胞自噬，CQ 能協(xié)同氟對Cathepsin K 基因和TRAP 基因進行下調(diào)；自噬激動劑RAP 能夠增強破骨細(xì)胞自噬，氟拮抗RAP 激動自噬的作用，抑制TRAP 基因上調(diào)。綜上所述，10 mg/L 氟刺激24 h 后能降低Cathepsin K 基因與TRAP 基因的表達，從而抑制破骨細(xì)胞骨吸收能力。

蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)及其下游分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)與破骨細(xì)胞增殖和活化密切相關(guān)。微管蛋白1 輕鏈3(LC3)通過Kindlin3 介導(dǎo)內(nèi)外信號調(diào)節(jié)整合素的激活，從而影響破骨細(xì)胞的遷移和最上游AKT 的激活[7-9]。mTOR 作為細(xì)胞代謝活動的中轉(zhuǎn)站，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化、自噬和凋亡等最基本細(xì)胞功能的關(guān)鍵因子，其活性取決于生長因子、激素、營養(yǎng)和應(yīng)激信號，此外mTOR 在決定骨穩(wěn)態(tài)方面也起著重要作用，是破骨細(xì)胞成熟和存活所必需的。mTOR早期作為自噬負(fù)調(diào)控因子受AKT 活化的影響，晚期激活自噬，形成的自噬小體為促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化提供能量，促進成骨，減少骨吸收[10]。在體內(nèi)，mTOR 激活顯著降低幼齡大鼠破骨細(xì)胞數(shù)量。在體外，mTOR 信號通路激活可減少小鼠的破骨細(xì)胞增殖，但也有學(xué)者報道，mTOR 活化后促進破骨細(xì)胞增殖并加劇骨吸收[11-12]，本研究顯示10 mg/L 氟化鈉刺激24 h 后，通過上調(diào)p-AKT 和p-mTOR 的表達可促進破骨細(xì)胞自噬，mTOR 磷酸化水平升高，同時降低Cathepsin K 和TRAP 基因的表達，一方面增強自噬，一方面降低骨吸收活性，可能與破骨細(xì)胞體外能量代謝方式不同有關(guān)，也可能該刺激時間點位于破骨細(xì)胞循環(huán)中正在分裂的階段，或分裂后待融合階段，導(dǎo)致破骨細(xì)胞骨吸收相關(guān)基因表達水平的降低[13-14]。ULK1 通常參與調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)和骨溶解性轉(zhuǎn)移，ULK1 表達上調(diào)可抑制破骨細(xì)胞分化，主要作用于PIK3C3 上游，磷酸化FLCN，促進自噬。AKT/mTOR 的活化晚期可誘導(dǎo)ULK1、ATG13、FIP200 聚合，誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬膜，從而啟動自噬小體的形成，而自噬小體的數(shù)量和分布又與破骨細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，自噬小體數(shù)量增加[15-19]，與本研究顯示氟能協(xié)同RAP 使p-ULK1表達量增高，增強自噬結(jié)果一致，ULK1 激活后可能延緩破骨細(xì)胞衰老，但氟干預(yù)加劇自噬，可能導(dǎo)致其走向凋亡，也可能是破骨細(xì)胞循環(huán)的中間環(huán)節(jié)，致使其分裂為子細(xì)胞作為破骨細(xì)胞的儲備細(xì)胞。

以10 mg/L 氟給藥能夠抑制骨吸收，可能對維持骨骼結(jié)構(gòu)和功能有一定程度的積極作用，但氟作為藥物在體內(nèi)可能存在脫靶效應(yīng)和潛在的不良反應(yīng)，對于氟誘導(dǎo)自噬致破骨細(xì)胞骨吸收的抑制靶點和氟在體內(nèi)影響破骨細(xì)胞形成、活性、功能仍需深入研究。