胡兵向登李健陸小嬋董洪松聶國輝*

1深圳市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（深圳 518025）

2河池市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（河池 547099）

氨基糖甙類抗生素是臨床上常用的抗革蘭陰性菌藥物，具有抗菌作用強(qiáng)、廣譜、各種環(huán)境溫度下穩(wěn)定性好、經(jīng)濟(jì)成本低等諸多優(yōu)勢。然而，氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致耳毒性的發(fā)生率高，能造成永久性的聽力下降，伴發(fā)眩暈、耳鳴等癥狀[1,2]。迄今為止，臨床上對氨基糖苷類抗生素的耳毒性缺乏有效的治療藥物，更多的措施是減少該類藥物的使用劑量和使用頻率，盡量降低其耳毒性風(fēng)險的發(fā)生。很多實(shí)驗(yàn)研究探索小分子藥物干預(yù)新霉素耳毒性從而達(dá)到保護(hù)聽覺毛細(xì)胞的目標(biāo)[3]?；A(chǔ)研究表明新霉素耳毒性分子機(jī)理與細(xì)胞氧化應(yīng)激及其誘發(fā)的細(xì)胞凋亡相關(guān)，抗氧化劑和抗凋亡劑有望降低新霉素耳毒性[4]。

異澤蘭黃素（5,7-dihydroxy-3′,4′,6-trimethoxyflavone，Eupatilin，EUP）是從蒿屬植物中分離到的親脂性黃酮類化合物[5]。由于研究發(fā)現(xiàn)EUP具有很好的抗炎作用，以EUP為主要成份的胃黏膜保護(hù)藥物StillenTM已在韓國等東亞國家被應(yīng)用于胃炎及胃潰瘍的臨床治療[6]。由此可見，EUP具備臨床藥物的安全性和穩(wěn)定性等特性。除了抗炎作用以外，EUP還具有明顯的抗氧化、抗凋亡及神經(jīng)保護(hù)等藥理效應(yīng)[7]。目前尚沒有研究報道EUP在聽覺毛細(xì)胞損傷中的作用。綜合分析EUP的藥物特點(diǎn)和效應(yīng)，本研究提出假說，認(rèn)為EUP可能具有通過抑制聽覺毛細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷從而保護(hù)毛細(xì)胞的作用。

為驗(yàn)證所提出的假說，本研究首先建立了HEI-OC1細(xì)胞和斑馬魚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。HEI-OC1細(xì)胞(House Ear Institute Organ of Corti l cell)是耳科研究常用的細(xì)胞模型，具有耳蝸毛細(xì)胞樣細(xì)胞的特征[8]。轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Brn3c：mGFP)的側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP），非常利于觀察毛細(xì)胞的損傷情況，是一個很好的篩選聽覺保護(hù)藥物的模式動物[9,10]。本研究利用HEI-OC1細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因斑馬魚模式動物，構(gòu)建新霉素耳毒性模型，進(jìn)而探索EUP通過拮抗新霉素耳毒性而發(fā)揮保護(hù)毛細(xì)胞的作用和相關(guān)機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

野生型斑馬魚和轉(zhuǎn)基因斑馬魚（Brn3c：mGFP）由復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉醫(yī)院李華偉教授惠贈。斑馬魚的繁殖、飼養(yǎng)條件、飼養(yǎng)方法均參照《Zebrafish Book》（http://www.zfin.org）進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均獲得深圳市第二人民醫(yī)院倫理委員會的審核批準(zhǔn)。

1.2 HEI-OC1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

HEI-OC1細(xì)胞來自于復(fù)旦大學(xué)眼耳鼻喉醫(yī)院李華偉教授實(shí)驗(yàn)室惠贈。細(xì)胞培養(yǎng)于33℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為高糖DMEM及10%胎牛血清，不含抗生素。細(xì)胞常規(guī)接種于96孔板，24小時貼壁后，分別給予不同濃度的新霉素和EUP藥物處理。

1.3 CCK-8檢測細(xì)胞存活率

處于對數(shù)生長期的HEI-OC1細(xì)胞（1×104個）接種于96孔板，經(jīng)過相應(yīng)的藥物處理后，細(xì)胞分為空白對照組，新霉素?fù)p傷組和EUP實(shí)驗(yàn)組。新霉素溶于純水，實(shí)驗(yàn)濃度梯度為1、5、10、20、40 mM，將各濃度的新霉素處理HEI-OC1細(xì)胞24小時后，吸出原培養(yǎng)基，加入含10%CCK-8溶液的新培養(yǎng)基，在37℃孵育2小時，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光值測定以確定構(gòu)建毛細(xì)胞損傷模型的相應(yīng)新霉素實(shí)驗(yàn)濃度。EUP溶于DMSO，母液濃度為10 mM，實(shí)驗(yàn)濃度梯度設(shè)置為5、10、20、40、80 μM。各孔的EUP早于新霉素2小時加入培養(yǎng)基中，新霉素加入24小時后，細(xì)胞處理完成，此時吸出原培養(yǎng)基，每孔加入含10%CCK-8溶液的新培養(yǎng)基，37℃孵育2小時，同樣采用酶標(biāo)儀測定吸光值。按照CCK-8試劑盒說明，細(xì)胞存活率計算方法為：細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）/（對照孔-空白孔）×100%。采用Graph-prism軟件統(tǒng)計分析各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測

使用熒光探針DCFH-DA（Molecular Probes，USA）對細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行檢測。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔5×104個細(xì)胞的密度接種到24孔板中。細(xì)胞經(jīng)EUP和新霉素處理（具體處理方法同1.3所述），吸出原培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌三次，然后在37℃下與DCFH-DA（濃度10mM）避光孵育30分鐘，然后立即在黑暗環(huán)境下采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。細(xì)胞熒光圖像用Olympus FV1200熒光顯微鏡拍攝，ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析并測算各組細(xì)胞的探針熒光強(qiáng)度。

1.5 細(xì)胞線粒體熒光染色

處于對數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)后種板貼壁，經(jīng)EUP和新霉素分別各項(xiàng)處理（具體處理方法同1.3所述），然后采用Mitotracker Red熒光染料（Thermofisher，USA）進(jìn)行線粒體熒光染色標(biāo)記。該紅色染料的積累取決于線粒體膜電位的高低，且在細(xì)胞固定和透化等步驟后依然維持在細(xì)胞內(nèi)，不會被洗掉。細(xì)胞核染色用DAPI孵育15分鐘?？勾銣鐒┓馄?。細(xì)胞熒光圖像用徠卡SP8共聚焦顯微鏡拍攝，ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析。

1.6 斑馬魚新霉素?fù)p傷模型構(gòu)建及藥物處理

熒光顯微鏡下觀察受精后5天的轉(zhuǎn)基因斑馬魚（Brn3c：mGFP）側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞，挑出毛細(xì)胞GFP陽性表達(dá)的斑馬魚純合子構(gòu)建新霉素?fù)p傷模型。挑出的斑馬魚純合子分為新霉素?fù)p傷組、EUP實(shí)驗(yàn)組和正常對照組。新霉素?fù)p傷組的處理為新霉素溶于飼養(yǎng)魚水，0.5 mM的新霉素?fù)p傷30分鐘。EUP實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚在含有EUP藥物的飼養(yǎng)魚水中4小時后，再加入0.5 mM新霉素，新霉素?fù)p傷時間同樣為30分鐘。正常對照組為無藥物處理。

1.7 斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的免疫組化標(biāo)記和細(xì)胞計數(shù)

按照1.6所述的藥物處理方法，經(jīng)新霉素和/或EUP藥物處理后的斑馬魚置于4%多聚甲醛室溫固定2小時；PBS潤洗3次，加入封閉液室溫封閉1小時；加入一抗，雞抗 GFP（Life Technologies，1：200）4℃孵育過夜。第二天，經(jīng)PBS潤洗3次，加入二抗室溫孵育1小時，再加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色15分鐘。抗淬滅劑封片后，在徠卡共聚焦顯微鏡（SP8）觀察成像，觀察并記錄側(cè)線L1-L5神經(jīng)丘中GFP陽性細(xì)胞數(shù)目，統(tǒng)計分析各組斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘GFP陽性毛細(xì)胞數(shù)量，比較各組平均神經(jīng)丘GFP陽性毛細(xì)胞數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 EUP顯著降低新霉素細(xì)胞毒性，提高HEIOC1細(xì)胞存活率

在新霉素處理HEI-OC1細(xì)胞24小時后，隨著新霉素濃度的增加（1，5，10，20，40 mM），CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測HEI-OC1細(xì)胞的活性逐漸降低，即是新霉素對HEI-OC1細(xì)胞的毒性效應(yīng)逐漸增加。在新霉素濃度為20 mM的條件下，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測HEIOC1細(xì)胞活性為50%。因此，選取20 mM的新霉素用于構(gòu)建新霉素耳毒性的細(xì)胞模型，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在20mM新霉素?fù)p傷條件下，給予不同濃度的EUP預(yù)處理可提高HEI-OC1細(xì)胞的存活率，最佳效果的濃度為40 μM，而當(dāng)EUP濃度增加到80 μM時細(xì)胞的存活率下降，反而增加了HEI-OC1細(xì)胞損傷(圖1)。該結(jié)果說明過高濃度的EUP對細(xì)胞具有毒性作用。因此，本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定濃度的EUP可顯著抑制新霉素對HEI-OC1細(xì)胞的毒性損傷，保護(hù)HEI-OC1細(xì)胞，但過高濃度的EUP具有潛在的細(xì)胞毒性作用(圖1)。

圖1 CCK-8檢測結(jié)果顯示EUP顯著降低新霉素誘發(fā)HEIOC1細(xì)胞死亡，EUP顯著增加HEI-OC1細(xì)胞的存活率（vs 0 μM,*：P＜0.05，**：P＜0.01）。Fig.1 CCK-8 results showed EUP significantly reduced the HEI-OC1 cell death induced by neomycin,and the cell viability of HEI-OC1 cells was increased with EUP treatment(other groups vs 0μM group,*：P＜0.05，**：P＜0.01).

2.2 EUP明顯降低新霉素誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平

DCFH-DA探針是一種可滲透細(xì)胞的，用于檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的探針。本研究檢測結(jié)果顯示HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA的強(qiáng)度在20mM新霉素作用24h后比正常對照組顯著升高，而EUP（40 μM）處理后細(xì)胞的DCFH-DA強(qiáng)度與對照組無差異，表明新霉素可顯著誘發(fā)HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)物，一定濃度的EUP對細(xì)胞內(nèi)ROS無明顯影響。當(dāng)EUP和新霉素共同作用HEI-OC1細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA熒光強(qiáng)度與新霉素?fù)p傷組相比顯著降低，表明EUP可顯著抑制新霉素導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS增多（圖2）。

圖2 ROS探針檢測顯示EUP顯著降低新霉素誘發(fā)HEIOC1細(xì)胞的ROS增多（**：P＜0.01）。A為對照組（Con），B為新霉素?fù)p傷組（neo），C為EUP單獨(dú)作用組（Eup），D為新霉素和EUP共同作用組（neo+Eup）。Fig.2 The ROS probe tests showed that EUP significantly inhibit the ROS product induced by neomycin in HEI-OC1 cells（**：P＜0.01）.Noted:A for control group,B for only neomycin group,C for only EUP group,D for neomycin plus EUP group.

2.3 EUP顯著降低新霉素誘發(fā)的線粒體損傷

采用MitoTrack Red紅色熒光染料去標(biāo)記細(xì)胞線粒體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HEI-OC1細(xì)胞在新霉素作用后與正常對照組相比，細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記線粒體的紅色熒光顯著減少，紅色熒光標(biāo)記在細(xì)胞核周圍分布不均，細(xì)胞核形態(tài)也不規(guī)則，說明新霉素顯著損傷HEI-OC1細(xì)胞的線粒體（圖3）。當(dāng)EUP（40 μM）和新霉素共同作用HEI-OC1細(xì)胞時，與新霉素?fù)p傷組相比較，細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記線粒體的紅色熒光顯著增多，說明EUP藥物干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)活的線粒體更多，線粒體活性得到了保護(hù)，顯著抑制新霉素對HEIOC1細(xì)胞線粒體的損傷（圖3）。

圖3 Mitotracker Red標(biāo)記線粒體顯示EUP顯著降低新霉素對HEI-OC1細(xì)胞線粒體的損傷。Fig.3 The Mitotracker Red probe tests showed EUP mainly decreased the damage of mitochondria induced by neomycin in HEI-OC1 cells.

2.4 EUP明顯降低新霉素對斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的損傷

本研究利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Brn3c：mGFP)構(gòu)建新霉素?fù)p傷模型。斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果顯示新霉素作用后側(cè)線毛細(xì)胞的數(shù)量較正常對照組顯著減少，兩組相比有顯著性差異（t=22.78，P＜0.01）；新霉素導(dǎo)致毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，纖毛消失（圖4）。當(dāng)EUP（60 μM）和新霉素共同處理斑馬魚時，與新霉素?fù)p傷時相比較，EUP藥物干預(yù)組的斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，兩組相比有顯著性差異（t=12.43，P＜0.01），說明毛細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量均得到了保護(hù)（圖4）。斑馬魚實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EUP可抑制新霉素對斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的損傷作用。

圖4 斑馬魚實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EUP顯著降低新霉素對側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的損傷（**：P＜0.01）。,每組均10條斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘（Neuromast,NM）（n=10）。Fig.4 The results of zebrafish model showed that EUP significantly inhibit the hair cell loss induced by neomycin in the neuromast of zebrafish lateral line（**：P＜0.01）.Noted:n=10 fishes in each group.

3 討論

胃黏膜保護(hù)藥StillenTM（DA-9601的商品名）是一種安全、有效、耐受性好的治療胃炎的臨床藥物，在韓國等東亞國家普遍應(yīng)用于消化系統(tǒng)疾病治療[7]。StillenTM中的主要成分是異澤蘭黃素（Eupatilin，EUP）。很多研究表明EUP是一個新型的抗氧化劑，能夠阻斷H2O2誘發(fā)的過氧化物反應(yīng)，顯著抑制硫酸亞鐵誘導(dǎo)的活性氧（ROS）合成[11]；EUP明顯降低細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)活性，抑制氧化應(yīng)激，同時可增加HSP70和Bcl-2的表達(dá)水平[12]。除此之外，EUP還具有抗凋亡、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等作用。研究發(fā)現(xiàn)EUP能保護(hù)腦缺血性疾病中的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞，還可以通過抑制NF-κB信號通路降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13,14]。有研究發(fā)現(xiàn)EUP通過降低磷酸化JNK蛋白和p38蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用而抑制藥物引起的腎上皮細(xì)胞損傷[15]。

本研究通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)揭示EUP對新霉素誘導(dǎo)的聽覺毛細(xì)胞損傷具有拮抗作用，可以降低新霉素的耳毒性。首先在CCK8實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EUP對新霉素誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞毒性具有拮抗作用，EUP能明顯提高HEI-OC1細(xì)胞的存活率。然后本研究開展了斑馬魚體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Brn3c：mGFP)，其側(cè)線毛細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，可直接在熒光顯微鏡下動態(tài)觀察側(cè)線毛細(xì)胞形態(tài)并計數(shù)側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)量。本研究利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Brn3c：mGFP)驗(yàn)證EUP對新霉素毛細(xì)胞毒性的拮抗作用，發(fā)現(xiàn)EUP可以保護(hù)斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞。結(jié)合多個實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本研究首次報道EUP具有拮抗新霉素耳毒性的作用，可能是一種新的聽覺毛細(xì)胞保護(hù)藥物。

新霉素誘導(dǎo)的聽覺毛細(xì)胞損傷與細(xì)胞內(nèi)ROS增多，以及線粒體功能異常引起的線粒體膜電位下降緊密相關(guān)[16,17]。以往研究發(fā)現(xiàn)新霉素誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS增多，破壞線粒體蛋白的正常合成，降低線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體通透性增加，引起線粒體損傷[16,17]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)在新霉素作用下HEIOC1細(xì)胞內(nèi)ROS顯著升高；而EUP作為一種強(qiáng)效抗氧化劑，明顯降低新霉素誘發(fā)的ROS升高。此外，本研究采用MitoTracker Red熒光染料，一種活細(xì)胞應(yīng)用的可滲透性的X-rosamine衍生物，只需簡單孵育就直接聚集在活性線粒體上，聚集的多少取決于線粒體膜電位的高低[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)新霉素?fù)p傷后HEI-OC1細(xì)胞MitoTracker Red染料聚集減少，紅色熒光分布不均，只在細(xì)胞質(zhì)的某處顯示；而EUP干預(yù)作用后明顯增加HEI-OC1細(xì)胞Mito-Tracker Red染料的聚集明顯增加，紅色熒光分布更多，說明EUP藥物干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)活的線粒體更多，線粒體膜電位得到了維持和保護(hù)[20]，這也可能是EUP能夠拮抗新霉素毒性而保護(hù)聽覺毛細(xì)胞的主要原因之一。

綜上所述，本研究第一次報道EUP，一種已經(jīng)臨床應(yīng)用的小分子藥物，具有拮抗新霉素耳毒性的作用。本研究發(fā)現(xiàn)EUP抑制毛細(xì)胞氧化應(yīng)激，保護(hù)毛細(xì)胞線粒體，提示其拮抗新霉素耳毒性作用與它的抗氧化效應(yīng)相關(guān)。因此，本研究的意義是首次發(fā)現(xiàn)EUP的抗耳毒性作用。關(guān)于EUP保護(hù)聽覺毛細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制，有待于進(jìn)一步的探索和研究。