王衛(wèi)東,董婧珂,龔永生,孫 慧,王 潔,金艷霞*

(1.湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室特色野菜良種繁育與綜合利用湖北省工程技術(shù)研究中心生物學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,中國(guó)湖北 黃石 435002;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院,中國(guó)江蘇 蘇州 215008;3.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國(guó)湖北 武漢 430072;4.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院,中國(guó)湖北 武漢 430030)

肺癌具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性,是發(fā)病率和死亡率很高的惡性腫瘤[1]。肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),其中NSCLC約占肺癌數(shù)目的85%[2]。根據(jù)組織亞型,NSCLC主要分為肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)、肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)和大細(xì)胞癌(large cell carcinoma,LCC)三類(lèi)。約70%肺癌患者確診時(shí)已有局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,失去根治性治療機(jī)會(huì),預(yù)后差;而早期NSCLC患者手術(shù)治療后5年生存率可達(dá)到80%左右[3],因此,早診早治可顯著提高肺癌患者的生存率。

臨床上肺癌篩查常見(jiàn)的血清腫瘤標(biāo)志物有癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、鱗狀細(xì)胞抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCA)和細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment,CYFRA21-1)等,但總體上現(xiàn)有診斷技術(shù)的靈敏度和特異性效果還不理想,并且在肺癌早診應(yīng)用中還有一定的局限性,因此,迫切需要高效、靈敏的早診標(biāo)志物用于肺癌篩查。

腫瘤抗原對(duì)腫瘤診斷和治療具有重要作用。臨床上可聯(lián)合多種血清腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤的早期診斷以及確定腫瘤亞型,如:人附睪蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)和 CYFRA21-1 及胃泌素釋放肽前體(pro-gastrin releasing peptide,ProGRP)聯(lián)合有望區(qū)分肺癌和良性疾病,以及區(qū)分肺癌組織亞型[4]。肺癌早期患者的免疫系統(tǒng)識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)抗原并產(chǎn)生自身抗體,這種自身抗體在血液中能長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在[5],可作為早期肺癌篩查標(biāo)記物[6]。Pei等[7]用血清學(xué)cDNA表達(dá)文庫(kù)(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries,SEREX)和Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析鑒定了腫瘤自身抗體anti-TOP2A和anti-ACTR3,并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)它們?cè)\斷早期肺癌的曲線下面積(area under the curve,AUC)分別為0.758和0.787,可作為早期肺癌血清標(biāo)志物。Jiang等[8]報(bào)道,新型的自身抗體用于早期肺癌免疫診斷具有高效性。此外,在肺癌早期中,與免疫相關(guān)的分子也發(fā)生變化,Ye等[9]通過(guò)對(duì)早期NSCLC血清中外周血白細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),與免疫相關(guān)的分子即酸性糖蛋白1(alpha-1-acid glycoprotein 1,AGP1),在早期NSCLC的診斷中效果較好,且酸性糖蛋白與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)聯(lián)合診斷可有效區(qū)分IA期NSCLC患者和健康對(duì)照者,AUC為0.985。因此,腫瘤免疫診斷有潛力作為靈敏檢測(cè)早期NSCLC的有效方法。

基于前期測(cè)定的早期NSCLC患者外周血中白細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[9],本研究進(jìn)行了深入挖掘,采用GO注釋分析了參與免疫應(yīng)答過(guò)程的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),篩選出免疫相關(guān)分子CD59,并利用Oncomine、GEPIA、UniProt、COMSIC、SWISS-MODEL、STRING 和Kaplan-Meier Plotter等數(shù)據(jù)庫(kù)分析了CD59在肺癌中的表達(dá)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化及其與患者生存之間的關(guān)系,為探索CD59參與肺癌發(fā)生機(jī)制和預(yù)后判斷提供了參考依據(jù)。

1 方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

本研究所用的早期NSCLC患者外周血中白細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)已提前發(fā)表,具體見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。測(cè)序后的RNA-seq reads數(shù)目用TopHat(v2.0.10)與人的基因組進(jìn)行比對(duì),再用Cufflinks軟件(v2.1.1)分析DEGs。人參考基因組(GRCh38)及其注釋文件從Ensembl網(wǎng)站(http://www.ensembl.org/index.html)下載?；虮磉_(dá)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄本豐度用FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)來(lái)表征。

1.2 生物信息分析

將DEGs進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能注釋(http://wego.genomics.org.cn/document),分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中參與免疫相關(guān)功能的差異表達(dá)分子;利用Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/login.html)和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn)分析CD59在肺癌組織中的mRNA表達(dá)變化[10];利用COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cancer.sanger.ac.uk,GRCh38 COSMIC v92)分析CD59在肺癌中的突變位點(diǎn);運(yùn)用SWISS-MODEL WORKSPACE(http://swissmodel.expasy.org)和SPDBV軟件(https://www.expasy.org/resources/swiss-pdbviewer)同源建模并分析CD59蛋白的3D結(jié)構(gòu);運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/cgi/input.pl)分析CD59蛋白與其他蛋白質(zhì)的相互作用;運(yùn)用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(https://kmplot.com/analysis/)分析CD59表達(dá)與肺癌患者的生存關(guān)系。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 免疫印跡分析

收集5例健康樣本、6例良性疾病患者和9例術(shù)前NSCLC IA期患者的血清,用于CD59蛋白表達(dá)水平的驗(yàn)證。所有樣本依據(jù)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)采集,樣本信息見(jiàn)表1。NSCLC患者通過(guò)低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描(low-dose computed tomography,LDCT)和組織病理學(xué)分析確診,肺癌患者分期按照國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(International Association for the Study of Lung Cancer,IASLC)的第八版TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)。采集血液2 mL后靜置,4℃400g離心20 min,將血清分裝至每管200 μL,立即凍存于-70℃?zhèn)溆?每份血清在使用前不超過(guò)兩次凍融。

表1 實(shí)驗(yàn)涉及的樣本信息Table 1 The information of samples used in this study

在肺癌患者手術(shù)中收集4對(duì)組織標(biāo)本,采集的癌旁組織距離癌組織2 cm,標(biāo)本采集后液氮速凍,立即置于-70℃凍存?zhèn)溆?。組織標(biāo)本先在6孔板中用滅菌的剪刀剪碎,加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)(Sigma-Aldrich公司,德國(guó))的RIPA裂解液和陶瓷珠,在全自動(dòng)樣品快速研磨儀中研磨5次,每次60 s。冰上放置30 min后,12 000 r/min離心10 min,收集的上清液即為組織勻漿的蛋白質(zhì)提取物。

用BCA(bicinchoninic acid)蛋白質(zhì)定量試劑盒(ThermoFisher公司,美國(guó))于OD562nm處測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。15 μg組織裂解液或5 μg稀釋的血清蛋白質(zhì)上樣至15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),電泳結(jié)束后,將凝膠中的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯[poly(1,1-difluoroethylene),PVDF]膜(Merck Millipore 公司,德國(guó))上,300 mA電流下轉(zhuǎn)膜45 min,再將PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。洗膜3次后,室溫下分別孵育CD59抗體(1∶2 000稀釋,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)和GAPDH抗體(1∶10 000稀釋,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)1 h;洗膜5次,室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀釋,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)或羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000稀釋,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)1 h;洗膜5次后,用ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Bio-Rad公司,美國(guó))顯影,最后用Vilber FUSION FX7化學(xué)發(fā)光成像儀拍照。蛋白質(zhì)條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度分析,用GraphPad Prism軟件(v8.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GO功能注釋分析肺癌中差異表達(dá)的免疫相關(guān)分子

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的原始數(shù)據(jù)用TopHat與人的基因組(GRCh38)進(jìn)行比對(duì),比對(duì)后的數(shù)據(jù)用Cufflinks軟件進(jìn)行DEGs分析。分析結(jié)果顯示:共比對(duì)到64 233個(gè)基因,其中可信基因有26 638個(gè)(FPKM＞0);依據(jù)|log2(肺癌組FPKM/健康組FPKM)|≥1,DEGs有5 676個(gè)(表2),其中297個(gè)基因是健康組特異性表達(dá)的,222個(gè)是患者組中特異性表達(dá)的;2 184個(gè)基因在早期患者中表達(dá)上調(diào),2 973個(gè)基因在早期患者中表達(dá)下調(diào)。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的差異表達(dá)基因分析Table 2 Analysis of DEGs by transcriptome sequencing

將差異表達(dá)的5 676個(gè)基因進(jìn)行GO功能注釋,分析早期NSCLC患者白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中參與免疫應(yīng)答過(guò)程的差異表達(dá)分子。結(jié)果顯示,一共鑒定到358個(gè)免疫相關(guān)分子。這些差異表達(dá)的免疫相關(guān)分子主要參與免疫應(yīng)答(immune response)、淋巴細(xì)胞刺激(lymphocyte costimulation)、免疫系統(tǒng)發(fā)育(immune system development)、淋巴細(xì)胞激活(leukocyte activation)、免疫應(yīng)答過(guò)程(immune effector process)和免疫反應(yīng)激活(activation of immuneresponse)等生物過(guò)程(圖1)。

圖1 GO功能注釋分析與免疫功能相關(guān)的差異表達(dá)分子Fig.1 GO functional annotation analysis of differentially expressed molecules involved in immune-related functions

2.2 CD59在肺癌中的表達(dá)

由于外周血白細(xì)胞中中性粒細(xì)胞約占50%,因此,根據(jù)GO注釋、有無(wú)商業(yè)化抗體以及是否利于腫瘤免疫診斷的血液學(xué)檢查,我們篩選了與中性粒細(xì)胞功能相關(guān)的顯著差異表達(dá)的CD59糖蛋白,其在肺癌患者外周血白細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),log2(肺癌組 FPKM/健康組 FPKM)值為-2.079 32。運(yùn)用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD59在癌癥中的表達(dá),通過(guò)設(shè)定閾值和統(tǒng)計(jì)分析的P值,我們發(fā)現(xiàn)在6種比較類(lèi)型中,CD59在肺癌組織中的表達(dá)都顯著下降(圖2A和表3)。進(jìn)一步的GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,CD59在肺鱗癌(LUSC)組織中的表達(dá)顯著降低,在肺腺癌(LUAD)組織中的表達(dá)有降低趨勢(shì)(圖2B)。

表3 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD59在肺癌中的表達(dá)Table 3 Analysis of the CD59 expression in lung cancer with Oncomine database

圖2 運(yùn)用Oncomine和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD59在肺癌中的表達(dá)(A)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD59在不同癌癥中的表達(dá)。黃色表示CD59 mRNA在腫瘤中過(guò)表達(dá),藍(lán)色表示CD59 mRNA在腫瘤中表達(dá)下降。分析類(lèi)型:腫瘤組vs.正常組;P值閾值:1E-4;變化倍數(shù)閾值:2;基因排名閾值:前10%;數(shù)據(jù)類(lèi)型:All;(B)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD59 mRNA在肺癌組織中的表達(dá)。紅色表示腫瘤組織(T),灰色表示正常組織(N)。|log2(變化倍數(shù))|閾值:1;P值閾值:0.01;log scale:是,用log2(TPM+1)表示;Jitter大小:0.4;匹配正常數(shù)據(jù):匹配TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中正常樣本和GTEx數(shù)據(jù)。TPM:Transcripts per million。Fig.2 Analysis of CD59 expression in lung cancer with Oncomine and GEPIA databases(A)Analysis of CD59 expression in different cancers based on Oncomine database.Yellow and blue represent significant overexpression and decreased expression of CD59 mRNA,respectively,in different cancers.Analysis type:Cancer vs.normal;Threshold(P-value):1E-4;Threshold(fold change):2;Threshold(gene rank):Top 10%;Data type:All;(B)Analysis of CD59 mRNA expression in lung cancer tissues with GEPIA database.Red and gray represent tumor(T)and normal(N)tissues,respectively.|log2(fold change)|cutoff:1;P-value cutoff:0.01;log scale:Yes,and represented by log2(TPM+1);Jitter size:0.4;Matched normal data:TCGA normal and GTEx data.TPM:Transcripts per million.

此外,通過(guò)對(duì)臨床組織標(biāo)本和血清標(biāo)本進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),相比癌旁組織,CD59蛋白在早期肺癌組織中的表達(dá)顯著下降,P=0.048 8(圖3A和3B);相對(duì)于健康對(duì)照組,CD59蛋白在早期肺癌血清中的表達(dá)也顯著下降,P=0.000 4(圖3C和3D)。另外,圖3D顯示,CD59蛋白在良性樣本和肺癌患者樣本間的表達(dá)水平無(wú)明顯差異,這可能是由于所用血清樣品量少,后續(xù)還需大量樣品進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖3 免疫印跡法檢測(cè)早期肺癌患者組織和血清中CD59蛋白的表達(dá)水平(A)組織裂解液;(B)灰度分析組織中CD59的表達(dá)。PN表示癌旁組織,PT表示腫瘤組織;(C)血清蛋白質(zhì)樣品;(D)灰度分析血清中CD59的表達(dá)。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤顯示,統(tǒng)計(jì)用非配對(duì)的t檢驗(yàn),*P＜0.05;**P＜0.01;***P＜0.001。Fig.3 Detection of the protein expression level of CD59 in tissues and sera of early lung cancer patients with Westernblot(A)Tissue lysates;(B)The gray analysis of CD59 expression in tissue lysates.PN:Paracancerous tissues,PT:Tumor tissues;(C)Serum samples;(D)The gray analysis of CD59 expression in sera.The data were statistically analyzed by GraphPad Prism(v8.0)with unpaired t-test,and represented by mean±SEM.*P＜0.05;**P＜0.01;***P＜0.001.

2.3 CD59蛋白的結(jié)構(gòu)

通過(guò)NCBI GeneBank和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/uniprot/P13987)分析CD59的編碼序列和位點(diǎn)(圖4A)。結(jié)果顯示:CD59的基因ID為966,定位在11號(hào)染色體上,編碼128個(gè)氨基酸,其中1～25位氨基酸為信號(hào)肽序列,103～128位氨基酸為前肽序列[11];CD59蛋白含有4個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)。COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)的分析顯示:CD59在肺癌中有3個(gè)已知位點(diǎn)存在突變,即第8、87和128位氨基酸(圖 4A)。

CD59蛋白的3D結(jié)構(gòu)如圖4B所示,主要由α螺旋和β折疊組成。研究報(bào)道,CD59蛋白分子有 5個(gè)二硫鍵[12],即氨基酸位點(diǎn) 28～51、31～38、44～64、70～88 和 89～94 分別形成二硫鍵(圖 4B)。COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,在肺癌患者中CD59有3個(gè)氨基酸位點(diǎn)即8、87和128位存在突變,其中第8和128位點(diǎn)的突變都屬于同義突變,而第87位氨基酸由酪氨酸(Y)突變?yōu)楸奖彼?F)。進(jìn)一步的SWISS-MODEL同源模建以及SPDBV軟件分析提示,87位酪氨酸(Y)僅與53位異亮氨酸(I)有氫鍵作用,突變成苯丙氨酸(F)后,與53位異亮氨酸(I)的氫鍵并沒(méi)有發(fā)生變化(圖4C)。

圖4 CD59的序列和3D結(jié)構(gòu)(A)CD59基因序列。紅色標(biāo)記表示突變信息,藍(lán)色標(biāo)記表示糖修飾位點(diǎn);(B)CD59蛋白的3D結(jié)構(gòu)?！癈”表示半胱氨酸;(C)運(yùn)用SPDBV軟件分析CD59蛋白87位酪氨酸和53位異亮氨酸之間的氫鍵作用(左邊),以及87位突變后的苯丙氨酸和53位異亮氨酸之間的氫鍵作用(右邊)。Fig.4 The sequence and 3D structure of CD59(A)The sequence of CD59.Red represents mutation,and blue represents glycosylation sites;(B)The 3D structure of CD59 protein.“C”represents cysteine;(C)Analysis of the hydrogen bonding force between tyrosine(Y)87 and isoleucine(I)53 in the CD59 protein(left),and the hydrogen bonding force between phenylalanine(F)87 and isoleucine(I)53 in the mutant CD59 protein(right)by SPDBV software.

2.4 CD59蛋白與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示,CD59蛋白主要與10種蛋白質(zhì)存在相互作用(圖5),即補(bǔ)體加速衰減因子(complement decay-accelerating factor,CD55)、補(bǔ)體成分C9、C3a過(guò)敏毒素趨化性受體(C3a anaphylatoxin chemotactic receptor,C3AR1)、補(bǔ)體成分 C8 α 鏈(C8A)和 β 鏈(C8B)、胰島素(insulin,INS)、尿激酶纖溶酶原激活物表面受體(urokinase plasminogen activator surface receptor,PLAUR)、白細(xì)胞表面抗原CD47、整合素alpha-M(integrin alpha-M,ITGAM)和癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子8(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8,CEACAM8),其中大部分蛋白質(zhì)參與免疫調(diào)控,如:CD55的唾液酸化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[13],CEACAM8與中性粒細(xì)胞脫顆粒有關(guān)[14]。我們前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也顯示,CD55和PLAUR的mRNA水平在早期NSCLC外周血白細(xì)胞中表達(dá)下降[9]。此外,有研究報(bào)道,CD55單抗有望用于胸膜轉(zhuǎn)移性肺癌的治療[15],含有CD55的腫瘤特異性溶瘤腺病毒也有潛力作為肺癌治療新方法[16];PLAUR參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和入侵[17～18]。總的來(lái)講,肺癌發(fā)生進(jìn)程與免疫調(diào)控密切相關(guān)[19～20],因而蛋白質(zhì)互作分析可為CD59蛋白參與肺癌發(fā)生機(jī)制的深入研究提供參考。

圖5 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析與CD59蛋白相互作用的蛋白質(zhì)(物種:人)Fig.5 The protein-protein interaction network diagram of CD59 using STRING database(organism:Homo sapiens)

2.5 CD59表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,CD59高表達(dá)肺癌患者(n=459)的生存時(shí)間為133.57個(gè)月;低表達(dá)肺癌患者(n=694)的生存時(shí)間為50.73個(gè)月(圖6),表明CD59低表達(dá)的肺癌患者的生存時(shí)間更短,提示CD59可作為肺癌患者生存期判斷的指標(biāo)。

圖6 CD59表達(dá)與肺癌患者生存之間的關(guān)系數(shù)據(jù)分析的參數(shù)設(shè)置:Affy ID:228748_at;患者分組:自動(dòng)選擇最佳臨界值;組織亞型:All;分期:All;AJCC TNM分期:All;性別:All;吸煙史:All;Cox回歸分析:單變量。Fig.6 The correlation between CD59 expression and the survival of lung cancer patientsParameter settings:Affy ID:228748_at;Split patients by:Auto select best cutoff;Histology:All;Stage and grade:All;AJCC stage T:All;AJCC stage N:All;AJCC stage M:All;Gender:All;Smoking history:All;Cox regression:Univariate.

3 討論

本研究通過(guò)Oncomine、GEPIA等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)CD59在肺癌組織中表達(dá)下降(圖2和表3),免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明CD59在早期NSCLC患者組織和血清中的表達(dá)都顯著下降(圖3),與前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果[9]一致。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/ENSG00000085-063CD59/tissue)的分析顯示,CD59在正常的肺組織中高表達(dá)。然而,Li等[21]報(bào)道,免疫組化結(jié)果顯示,CD59在20例NSCLC組織中的表達(dá)量高于癌旁組織中的表達(dá)量,并且在H157細(xì)胞中敲低CD59表達(dá)可抑制H157細(xì)胞的增殖和增強(qiáng)細(xì)胞凋亡,表明CD59可作為NSCLC治療的靶點(diǎn)。Lin等[22]則報(bào)道,在肺癌細(xì)胞中敲低CD59表達(dá),可抑制肺腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。上述相反的結(jié)果可能是由于CD59在腫瘤早晚期樣本中表達(dá)不同,但具體機(jī)理還需要更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。

運(yùn)用COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD59基因在肺癌患者中的突變情況,發(fā)現(xiàn)有3個(gè)氨基酸位點(diǎn)即第8、87和128位存在突變(圖4)。其中,第8位氨基酸位點(diǎn)位于信號(hào)肽序列中,在CDS序列中即24位C突變成G,也就是密碼子GTC突變?yōu)镚TG,二者都編碼纈氨酸(V),屬于同義突變。第87位氨基酸位點(diǎn)在CDS序列中即260位A突變成T,也就是密碼子TAC突變?yōu)門(mén)TC,所編碼氨基酸由酪氨酸(Y)突變?yōu)楸奖彼?F),COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道該位點(diǎn)屬于錯(cuò)義突變。我們通過(guò)SWISS-MODEL同源模建CD59的3D結(jié)構(gòu),運(yùn)用SPDBV軟件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),87位酪氨酸(Y)僅與53位異亮氨酸(I)有氫鍵作用,突變成苯丙氨酸(F)后,與53位異亮氨酸(I)的氫鍵并沒(méi)有發(fā)生變化。UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)有報(bào)道,該87位氨基酸由酪氨酸(Y)突變?yōu)榫彼?R),對(duì)蛋白質(zhì)功能沒(méi)有影響。第128位氨基酸位點(diǎn)在CDS序列中是384位C突變成G,即密碼子CCC突變?yōu)镃CG,都編碼脯氨酸(P),也屬于同義突變。第128位氨基酸位于前肽序列中,切割后才為成熟形式的CD59蛋白[11]。因此,現(xiàn)有數(shù)據(jù)提示,在肺癌患者中CD59蛋白3個(gè)已知的突變位點(diǎn)對(duì)該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯影響。

CD59蛋白屬于補(bǔ)體,是先天免疫系統(tǒng)的一部分,補(bǔ)體系統(tǒng)的激活以級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)的形式發(fā)生[23],當(dāng)補(bǔ)體激活不足或過(guò)度時(shí)可導(dǎo)致多種疾病[24]。CD59蛋白為相對(duì)分子質(zhì)量為18～20 kD的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)錨定的糖蛋白,是膜結(jié)合性補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(membranebound complement regulatory proteins,mCPRs)的重要成員,在血液和多種組織中表達(dá)[25～26]。CD59蛋白有兩種存在形式,包括膜附著性CD59蛋白和可溶性CD59蛋白,附著性CD59蛋白的主要功能是在補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的終末階段抑制膜攻擊復(fù)合體(membrane attack complex,MAC)的形成,從而保護(hù)宿主細(xì)胞使其不受MAC裂解效應(yīng)的影響[27～28]。當(dāng)補(bǔ)體激活不足時(shí),MAC可以通過(guò)激活細(xì)胞周期、預(yù)防細(xì)胞凋亡、上調(diào)致癌生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子并抑制淋巴細(xì)胞的活化增殖等方式,誘導(dǎo)或維持腫瘤發(fā)生[29]。CD59分子還可參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)過(guò)程,誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的激活,并且影響T淋巴細(xì)胞增殖及其分泌細(xì)胞因子的能力[30]。本研究發(fā)現(xiàn),CD59蛋白與神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)蛋白CD47有相互作用(圖5)。有研究報(bào)道,CD47的表達(dá)水平與NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān),過(guò)表達(dá)CD47可以促進(jìn)NSCLC的入侵和轉(zhuǎn)移,可作為NSCLC的不良預(yù)后指標(biāo),用于疾病進(jìn)程監(jiān)控和NSCLC治療的靶點(diǎn)[31]。Kleczko等[32]報(bào)道,靶向補(bǔ)體途徑可作為肺癌治療的策略,如前所述,CD55單抗可用于胸膜轉(zhuǎn)移性肺癌的治療[15],推測(cè)作為補(bǔ)體途徑的CD59分子也可能參與調(diào)控肺癌的發(fā)生。

總的來(lái)講,本研究發(fā)現(xiàn)CD59在肺癌組織和血清中的表達(dá)低于正常對(duì)照組,且CD59低表達(dá)的肺癌患者生存更差,推測(cè)是因?yàn)镃D59可作為人自然殺傷細(xì)胞激活的共受體,當(dāng)CD59低表達(dá)不利于自然殺傷細(xì)胞的激活時(shí),可能引起免疫逃逸,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性增殖,患者生存更差[33]。本研究表明,免疫分子CD59有可能作為肺癌預(yù)后生存標(biāo)志物,為進(jìn)一步探索CD59參與肺癌發(fā)生機(jī)制和預(yù)后判斷提供了參考依據(jù)。