宮 強(qiáng)，翟文漢，李雅靜，田佳雨

（河南科技大學(xué)河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023）

銅綠假單胞菌又稱(chēng)綠膿桿菌，廣泛分布于水、空氣、土壤等自然環(huán)境以及人類(lèi)和多種動(dòng)物的皮膚、呼吸道及腸道中。該菌屬于人畜共患條件性病原菌，是醫(yī)院內(nèi)部重要的致病菌之一，尤其是燒傷病人及重癥監(jiān)護(hù)室病人易感染該菌，常表現(xiàn)為肺炎、急性腦膜炎、敗血癥等，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康[1]。除人類(lèi)外，多種動(dòng)物如禽類(lèi)、水貂、豬、牛等也可感染銅綠假單胞菌，從而給養(yǎng)殖業(yè)造成危害。目前無(wú)論醫(yī)學(xué)臨床還是獸醫(yī)臨床上對(duì)于該菌的控制措施仍然以抗生素治療為主。然而近年來(lái)，銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素如頭孢菌素類(lèi)、β 內(nèi)酰胺類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)等均產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，甚至對(duì)部分抗生素的耐藥性達(dá)到了100%[2-4]。其中耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌已被WHO 列為急需新藥開(kāi)發(fā)以控制感染的三大病原菌之一[5]。因此，需要采取更加有效的措施來(lái)預(yù)防和控制該病。對(duì)于細(xì)菌類(lèi)疾病的防控，除應(yīng)用抗菌藥物外，疫苗免疫仍為有效的手段之一。目前關(guān)于銅綠假單胞菌疫苗的研究報(bào)道雖然不少，然而迄今為止在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上均無(wú)可供選擇的商品化疫苗，因此研制針對(duì)該菌的新型有效疫苗迫在眉睫。本研究構(gòu)建了銅綠假單胞菌oprD基因的DNA 疫苗和重組亞單位疫苗，通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了兩種疫苗單獨(dú)應(yīng)用及先后應(yīng)用時(shí)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平及為小鼠提供的保護(hù)效果，以期為銅綠假單胞菌新型疫苗的開(kāi)發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑銅綠假單胞菌CAU0792 株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；健康6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠購(gòu)自河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院；真核表達(dá)載體pcaggs-HA 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所王春來(lái)副研究員惠贈(zèng)；原核表達(dá)載體pET-32a為本實(shí)驗(yàn)室保存；羊抗鼠HRP-IgG購(gòu)自諾唯贊生物科技公司；限制性核酸內(nèi)切酶SacI、NheI、BamH I 和XhoI 均購(gòu)自TaKaRa 公司；小鼠IFN-γ 和IL-4 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2oprD基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定根據(jù)銅綠假單胞oprD基因序列（KJ482590.1）及pcaggs-HA 的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增該基因的PCR 引物：5′-CGAGCTCATGAAAGTGATGAAGTGGAGCGC-3′/5′-C TAGCTAGCTTACAGGATCGACAGCGGATAGTCGA-3′，下劃線分別為SacI 和NheI 位點(diǎn)。以提取的銅綠假單胞菌基因組DNA 為模板，采用上述引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增oprD基因，經(jīng)序列測(cè)定正確后將其純化片段SacI/NheI 雙酶切后與同樣經(jīng)酶切處理的真核表達(dá)載體pcaggs-HA 連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)上述兩種限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為pOPRD。

1.3 重組OprD 蛋白亞單位疫苗、滅活疫苗和外膜蛋白疫苗的制備根據(jù)原核表達(dá)載體pET-32a 多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增oprD基因的特異性引物：5′-CGGGATCCATGAAAGTGATGAAGTGGAGCGC-3′/5′-CCCTCGAGTTACAGGATCGACAGCGGATAGTCGA-3′，下劃線部分分別為BamH I 和XhoI 位點(diǎn)。以銅綠假單胞菌基因組DNA 為模板，采用上述引物PCR 擴(kuò)增該基因并測(cè)序，隨后將其與pET-32a 連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pET-OPRD。將pET-OPRD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，以IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，并以Ni-IDA 蛋白純化試劑盒對(duì)目的蛋白純化后進(jìn)行SDS-PAGE 分析，并測(cè)定重組蛋白濃度。隨后向純化后的重組蛋白中加入總體積6%的吐溫-80 攪拌均勻后作為水相，將白油和司班-80 按照94∶6 的比例混勻，再向其中加入總體積2%的硬脂酸鋁混合后作為油相，水相和油相按照1∶2 的比例混合后充分乳化，制備成重組OprD 蛋白亞單位疫苗，使其中的蛋白濃度為1 mg/mL。同時(shí)制備銅綠假單胞菌懸液并調(diào)整其濃度為2×1010cfu/mL，經(jīng)甲醛滅活后按上述方法制備水相和油相，乳化后制備銅綠假單胞菌的滅活疫苗。同時(shí)參考文獻(xiàn)[6]方法提取銅綠假單胞菌的外膜蛋白，并按照上述方法制備成外膜蛋白疫苗（OMP 疫苗）。

1.4 小鼠的免疫6 周齡～8 周齡健康BALB/c 小鼠共210 只，隨機(jī)均分為7 組，分別為DNA 疫苗組、重組亞單位疫苗組、DNA 疫苗初免-重組亞單位疫苗加強(qiáng)免疫組（簡(jiǎn)稱(chēng)初免-加強(qiáng)免疫組）、外膜蛋白疫苗組、滅活疫苗組、空載體pcaggs-HA 對(duì)照組和PBS 對(duì)照組。大量制備重組質(zhì)粒pOPRD 及空載體pcaggs-HA，以pH7.2 的PBS 調(diào)整至1 μg/μL。DNA 疫苗組、空載體pcaggs-HA 對(duì)照組和PBS 對(duì)照組的小鼠分別每只肌肉注射免疫100 μL 的重組質(zhì)粒pOPRD、空載體pcaggs-HA 和PBS。重組亞單位疫苗組、外膜蛋白疫苗組和滅活疫苗組的小鼠分別每只背部皮下多點(diǎn)注射100 μL 的重組亞單位疫苗、OMP 疫苗和滅活疫苗。上述各組均免疫3 次，每次間隔2 周。初免-加強(qiáng)免疫組初次免疫時(shí)每只小鼠肌注100 μL 的重組質(zhì)粒pOPRD，二免和三免時(shí)背部皮下注射100 μL 的重組亞單位疫苗。

1.5 各組小鼠血清特異性抗體檢測(cè)上述各組小鼠以相應(yīng)疫苗從初次免疫后第1 周開(kāi)始，每周采血分離血清，分別以2×109cfu/mL 的銅綠假單胞菌菌懸液、20 μg/mL 的銅綠假單胞菌外膜蛋白和20 μg/mL純化的重組OprD 蛋白為包被抗原，以1∶2 000 稀釋的羊抗鼠HRP-IgG 為二抗，經(jīng)間接ELISA方法測(cè)定各免疫組小鼠的血清特異性抗體水平，共檢測(cè)6周[6]。

1.6 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)每次免疫后2周時(shí)，每組各隨機(jī)取5 只小鼠，脫頸剖殺后按常規(guī)方法無(wú)菌分離制備脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL。于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入50 μL上述細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照孔，實(shí)驗(yàn)孔和陰性對(duì)照孔各設(shè)3 個(gè)重復(fù)。分別向各實(shí)驗(yàn)孔及陰性對(duì)照孔中加入50 μL 銅綠假單胞菌外膜蛋白和50 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液。隨后將其放置于37 ℃5% CO2培養(yǎng)72 h，再向各孔加入5 mg/mL 的MTT 10 μL，繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱中反應(yīng)3 h。隨后離心棄上清，向各孔加入150 μL 的DMSO，37 ℃放置10 min，以酶標(biāo)儀測(cè)定OD570nm值，按公式刺激指數(shù)（SI）=OD570nm（實(shí)驗(yàn)孔）/OD570nm（陰性對(duì)照孔）計(jì)算，分析各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況。

1.7 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ和IL-4 分泌水平的測(cè)定每次免疫2 周后，按上述方法制備各組小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液，以銅綠假單胞菌外膜蛋白刺激后在37 ℃5%CO2培養(yǎng)72 h，離心取上清，以小鼠IFN-γ 和IL-4 檢測(cè)試劑盒測(cè)定各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的這兩種細(xì)胞因子濃度。

1.8 小鼠攻毒試驗(yàn)第3 次免疫后2 周時(shí)，以銅綠假單胞菌CAU0792 菌液對(duì)各免疫組剩余小鼠經(jīng)肌肉注射攻毒，攻毒劑量為1.35×1010cfu/只，攻毒后繼續(xù)飼養(yǎng)2 周，每日觀察記錄小鼠的存活情況，繪制各免疫組小鼠的存活曲線，計(jì)算保護(hù)率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SAS 9.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析各疫苗組間差異，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pOPRD 和pET-OPRD 的酶切鑒定結(jié)果PCR 擴(kuò)增銅綠假單胞菌的oprD基因，并將其分別與真核表達(dá)載體pcaggs-HA 和原核表達(dá)載體pET-32a 連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后提取質(zhì)粒，分別以限制性內(nèi)切酶SacI/NheI 和BamH I/XhoI 雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，瓊脂糖凝膠電泳均出現(xiàn)1 340 bp的目的條帶（圖1），大小與預(yù)期相符。表明重組質(zhì)粒pOPRD 和pET-OPRD 正確構(gòu)建。

圖1 重組質(zhì)粒pOPRD（A）和pET-OPRD（B）的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of the two enzymes digestion of pOPRD(A)and pET-OPRD(B)

2.2 重組OprD 蛋白的表達(dá)及純化結(jié)果將重組質(zhì)粒pET-OPRD 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，以IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并利用Ni-IDA 蛋白純化試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE 分析。結(jié)果顯示，有分子量大小約為65 ku 重組目的蛋的表達(dá)，與預(yù)期大小一致，且經(jīng)純化后可得到較純的特異性目的蛋白（圖2），表明重組OprD蛋白正確表達(dá)，且獲得了該純化蛋白。經(jīng)測(cè)定純化蛋白濃度達(dá)2.36 mg/mL。

圖2 重組OprD蛋白的表達(dá)（A）與純化（B）鑒定結(jié)果Fig.2 Expression(A)and purification(B)of recombinant OprD protein

2.3 各組小鼠血清抗體檢測(cè)結(jié)果初次免疫后每周斷尾采血，分離血清，分別采用間接ELISA 方法測(cè)定各組小鼠的血清特異性抗體水平。結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，各疫苗誘導(dǎo)的小鼠血清抗體水平均呈明顯上升趨勢(shì)，而pcaggs-HA 對(duì)照組和PBS 對(duì)照組的血清抗體則始終處于較低水平。初次免疫后，雖然以不同包被抗原檢測(cè)到的各組抗體水平有所不同，但各疫苗組之間并無(wú)顯著差異（P＞0.05）。以銅綠假單胞菌菌懸液為包被抗原時(shí)的測(cè)定結(jié)果顯示，二免后滅活疫苗組和外膜蛋白疫苗組的抗體水平仍無(wú)顯著差異（P＞0.05），但兩者均顯著高于其他各疫苗組。三免后滅活疫苗組的抗體水平顯著高于外膜蛋白疫苗組（P＜0.05），而外膜蛋白疫苗組則顯著高于DNA 疫苗組、重組亞單位疫苗組和初免-加強(qiáng)免疫組（P＜0.05），但后三者之間始終差異不顯著（P＞0.05）（圖3A）。

以銅綠假單胞菌的外膜蛋白為包被抗原檢測(cè)各疫苗誘導(dǎo)的小鼠血清抗體水平，結(jié)果顯示，從第3 周開(kāi)始外膜蛋白疫苗組的抗體水平顯著高于其他疫苗組（P＜0.05）。從第4周開(kāi)始初免-加強(qiáng)免疫組和滅活疫苗組的抗體水平顯著高于DNA 疫苗組和重組亞單位疫苗組（P＜0.05）。初免-加強(qiáng)免疫組和滅活疫苗組之間始終無(wú)顯著差異（P＞0.05），DNA 疫苗組和重組亞單位疫苗組之間也始終無(wú)明顯差異（P＞0.05）（圖3B）。

以重組OprD 蛋白為包被抗原檢測(cè)各免疫組的血清抗體，結(jié)果顯示，從第3 周開(kāi)始，初免-加強(qiáng)免疫組和重組亞單位疫苗組的抗體水平顯著高于DNA 疫苗組（P＜0.05），而DNA 疫苗組又顯著高于滅活疫苗組和外膜蛋白疫苗組（P＜0.05），但初免-加強(qiáng)免疫組和重組亞單位疫苗組之間始終無(wú)明顯差異（P＞0.05）。從第4 周開(kāi)始，外膜蛋白疫苗組的抗體水平顯著高于滅活疫苗組（P＜0.05）（圖3C）。

圖3 免疫小鼠血清抗體檢測(cè)的結(jié)果Fig.3 The levels of serum antibodies in immunized mice

上述抗體檢測(cè)結(jié)果表明，雖然以不同抗原檢測(cè)到的各疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體水平差異較大，但總體上本研究制備的各類(lèi)疫苗均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答水平。

2.4 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果每次免疫2 周后制備免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，以銅綠假單胞菌外膜蛋白誘導(dǎo)后，采用MTT 法測(cè)定各組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖水平，結(jié)果顯示，初次免疫后各疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞的SI值雖然有所不同，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；第2次免疫后，DNA疫苗組的SI值顯著低于其他4個(gè)疫苗組（P＜0.05），而后四者之間則差異不顯著（P＞0.05）；三免后，初免-加強(qiáng)免疫組和外膜蛋白疫苗組的SI 值顯著高于重組亞單位疫苗組和滅活疫苗組（P＜0.05），且重組亞單位疫苗組和滅活疫苗組的SI值又顯著高于DNA疫苗組（P＜0.05）（圖4）。表明銅綠假單胞菌外膜蛋白誘導(dǎo)的初免-加強(qiáng)免疫組和外膜蛋白疫苗組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，重組亞單位疫苗組和滅活疫苗組次之，而DNA疫苗組則最差。

圖4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Splenic lymphocytes proliferation in vaccinated mice

2.5 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ和IL-4 分泌水平測(cè)定結(jié)果每次免疫后2 周時(shí)制備免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液，以銅綠假單胞菌的外膜蛋白為刺激物，利用ELISA 試劑盒檢測(cè)各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ 和IL-4的濃度。結(jié)果顯示，初次免疫后各疫苗誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ 和IL-4的濃度均無(wú)明顯差別（P＜0.05）。二免和三免后初免-加強(qiáng)免疫組小鼠分泌的IFN-γ 濃度顯著高于其他各組（P＞0.05）。雖然第2 次免疫后滅活疫苗組和外膜蛋白疫苗組的IFN-γ 濃度與DNA 疫苗組和重組亞單位疫苗組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），但第3 次免疫后前兩組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ 濃度顯著高于后兩組（P＜0.05）（圖5A）。IL-4 檢測(cè)結(jié)果則與脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似，二免和三免后初免-加強(qiáng)免疫組、外膜蛋白疫苗組、重組亞單位疫苗組和滅活疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IL-4 濃度顯著高于DNA 疫苗組（P＜0.05）。且三免后初免-加強(qiáng)免疫組和外膜蛋白疫苗組的IL-4濃度高于重組亞單位疫苗組和滅活疫苗組（P＜0.05）（圖5B）。表明各疫苗均具有一定的誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生IFN-γ 和IL-4的能力，尤以DNA疫苗初免-重組亞單位疫苗加強(qiáng)免疫時(shí)效果更好。

圖5 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ（A）和IL-4（B）水平Fig.5 Levels of IFN-γ(A)and IL-4(B)from spleen lymphocytes of vaccinated mice

2.6 小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果各免疫組小鼠于三免2 周后以銅綠假單胞菌攻毒，繼續(xù)飼養(yǎng)觀察2 周，繪制小鼠的存活曲線，計(jì)算保護(hù)率。結(jié)果顯示，空載體pcaggs-HA 對(duì)照組和PBS 對(duì)照組的小鼠在攻毒后4 d 內(nèi)迅速死亡。DNA 疫苗組小鼠在攻毒當(dāng)天即出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而其余各免疫組則在攻毒后2 d 陸續(xù)出現(xiàn)死亡小鼠。DNA 疫苗組、重組亞單位疫苗組、初免-加強(qiáng)免疫組和外膜蛋白疫苗組的小鼠分別于第6 d、第5 d、第4 d 和第4 d 后存活數(shù)量不再發(fā)生變化，滅活疫苗組僅在攻毒后2 d 死亡一只小鼠。上述各免疫組的保護(hù)率分別為53.3%、60%、73.3%、80%和93.3%（圖6）。表明以銅綠假單胞菌oprD基因制備的DNA疫苗和重組亞單位疫苗均可為免疫小鼠提供一定的臨床保護(hù)，且兩者采用初免-加強(qiáng)免疫策略時(shí)的效果優(yōu)于各單一疫苗免疫。

圖6 攻毒后各組小鼠存活曲線Fig.6 Survival curve of vaccinated mice after challenge

3 討 論

銅綠假單胞菌作為重要的人畜共患病原菌之一，近年來(lái)因其耐藥性的迅速增強(qiáng)而受到研究者和臨床醫(yī)學(xué)工作人員的關(guān)注。為解決該病原菌的耐藥性所帶來(lái)的臨床治療之難題，研制針對(duì)該菌的有效疫苗勢(shì)在必行。雖然目前尚無(wú)可用的商品化疫苗，但針對(duì)銅綠假單胞菌的多種疫苗包括滅活疫苗、重組亞單位疫苗、DNA 疫苗、多表位疫苗等均有相關(guān)研究報(bào)道[7-10]。本研究室前期以銅綠假單胞菌的oprL、oprF和flgE基因構(gòu)建了多種單價(jià)DNA 疫苗、融合DNA 疫苗和聯(lián)合DNA 疫苗，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示融合和聯(lián)合DNA 疫苗的免疫效果優(yōu)于單價(jià)DNA 疫苗，但仍不及滅活疫苗[11-14]。因此需進(jìn)一步研究更加有效的銅綠假單胞菌新型疫苗。

DNA 疫苗和重組亞單位疫苗自上世紀(jì)八九十年代問(wèn)世以來(lái)，因具有工藝簡(jiǎn)單、成本較低、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，兩種疫苗均可誘導(dǎo)較為有效的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[15-16]。選擇有效的抗原基因是影響新型疫苗免疫效果的關(guān)鍵因素之一。目前可用于相關(guān)新型疫苗研究的銅綠假單胞菌免疫原基因包括外膜蛋白基因、鞭毛蛋白基因以及外毒素基因等[17]，其中又以外膜蛋白基因制備重組亞單位疫苗和DNA 疫苗的研究報(bào)道較多。銅綠假單胞菌的外膜蛋白對(duì)于該菌的生長(zhǎng)繁殖、環(huán)境適應(yīng)、致病性及耐藥性均起到至關(guān)重要的作用。由于不同血清型銅綠假單胞菌的外膜蛋白具有高度的一致性，因此外膜蛋白是該菌理想的候選疫苗分子。在銅綠假單胞菌的外膜中至少存在D、E、F、G、H 等16 種外膜蛋白[18]，其中OprD 蛋白是銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的主要介質(zhì)，與細(xì)菌的耐藥性關(guān)系密切，且有研究表明該蛋白具有一定的免疫原性[19-21]。但以該蛋白編碼基因制備新型疫苗的相關(guān)報(bào)道較少。本研究以oprD基因同時(shí)制備了DNA 疫苗和重組亞單位疫苗，檢測(cè)了兩種疫苗單獨(dú)免疫和采用DNA 疫苗初免-重組亞單位疫苗加強(qiáng)免疫策略時(shí)的免疫效果。

血清抗體水平可反映疫苗誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的能力，本研究測(cè)定了各疫苗免疫后小鼠針對(duì)銅綠假單胞菌菌懸液、外膜蛋白和重組OprD 蛋白產(chǎn)生的血清特異性抗體水平。由于包被抗原不同，因此檢測(cè)到的各疫苗誘導(dǎo)的抗體水平也有所不同。分析結(jié)果可知，當(dāng)包被抗原與疫苗成分相同或相近時(shí)，測(cè)得的抗體水平最高，例如以銅綠假單胞菌菌懸液為包被抗原時(shí)測(cè)得的滅活疫苗組的血清抗體水平明顯高于其他各組，而分別以外膜蛋白和重組OprD 蛋白為包被抗原時(shí)測(cè)得的外膜蛋白疫苗組和重組亞單位疫苗組的抗體水平則相對(duì)較高。總體而言，DNA 疫苗初免-重組亞單位疫苗加強(qiáng)免疫時(shí)誘導(dǎo)免疫小鼠抗體應(yīng)答的能力優(yōu)于兩種疫苗單獨(dú)免疫。

免疫小鼠的淋巴細(xì)胞增殖水平和細(xì)胞因子分泌水平可在一定程度上反映疫苗誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答能力的高低。本研究測(cè)定了銅綠假單胞菌外膜蛋白誘導(dǎo)下各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖水平及其分泌的Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ 和Th2 型細(xì)胞因子IL-4 的濃度。結(jié)果表明隨著免疫次數(shù)的增加，各疫苗誘導(dǎo)的免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和兩種細(xì)胞因子的分泌水平均有所提高。第2 次和第3 次免疫后，初免-加強(qiáng)免疫組的IFN-γ 濃度明顯高于其他各組，表明以oprD基因的DNA 疫苗初免后再以該蛋白的重組亞單位疫苗加強(qiáng)免疫可誘導(dǎo)較好的Th1 型免疫應(yīng)答。三免后初免-加強(qiáng)免疫組的SI 值和IL-4 的濃度與外膜蛋白疫苗組相當(dāng)，顯著優(yōu)于其他各組，表明初免-加強(qiáng)免疫也可誘導(dǎo)較好的Th2 型免疫應(yīng)答。攻毒試驗(yàn)結(jié)果也顯示DNA 疫苗初免-重組亞單位疫苗加強(qiáng)免疫為小鼠提供的保護(hù)效果優(yōu)于DNA 疫苗單獨(dú)免疫和重組亞單位疫苗單獨(dú)免疫。本研究首次以銅綠假單胞菌的oprD基因制備了DNA 疫苗和重組亞單位疫苗，并以初免-加強(qiáng)免疫的方式檢測(cè)了兩種疫苗聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的免疫效果，從而為銅綠假單胞菌新型疫苗及其免疫策略的研究奠定了基礎(chǔ)，為銅綠假單胞菌相關(guān)疾病的防控提供了實(shí)驗(yàn)參考。