董秀梅，李秀云，劉 念，楊 巍，鄧愛懷，呂文鵬，關(guān)春宇，張 萍，鄒希明*，師東方*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動物疫病病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室東北科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱北方森林動物園，黑龍江 哈爾濱 150322）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）廣泛分布于土壤、污水、飼料和動物腸道中，該菌可導(dǎo)致動物的壞死性腸炎、腸毒血癥，也可以導(dǎo)致人腹瀉和食物中毒等疾病[1-2]，是一種重要的人獸共患病原菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病作用與其分泌的20 多種外毒素及酶類相關(guān)，依據(jù)其分泌的主要毒素α、β、ε和ι，可將其分成A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）和E（α、ι）5 種毒素型[3]。其中α 毒素由染色體定位的cpa基因編碼，所有毒素型的產(chǎn)氣莢膜梭菌均可產(chǎn)生α 毒素。產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氧條件下8 h即可進(jìn)入對數(shù)生長期，并分泌大量毒素，因此由該菌引起的疾病具有發(fā)病急、病程短的特征，患病動物往往因來不及救治而死亡，因此給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌病在不同國家和地區(qū)的畜禽養(yǎng)殖場中廣泛存在，且A 型是主要的毒素型。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌也是造成野生動物如東北虎、非洲獅、犀牛、馴鹿、羊駝等急性死亡的主要病原菌[4-9]。但關(guān)于狼感染產(chǎn)氣莢膜梭菌引起急性死亡的病例尚未見報(bào)道。

狼（Canis Lupus）屬于食肉目犬科犬屬，在我國屬國家二級保護(hù)野生動物。我國曾是狼種群最大的國家之一，但因生存環(huán)境的破壞以及人為大量撲殺，導(dǎo)致狼群的數(shù)量急劇減少。目前，野外生存的狼群只在北緯30 度以北地區(qū)存在。城市中的狼主要集中于國內(nèi)少數(shù)野生動物園，數(shù)量較少。2020 年9 月15日清晨，黑龍江省某動物園飼養(yǎng)員在狼散放區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)5 匹死狼，并在附近地面發(fā)現(xiàn)嘔吐物及血性腹瀉物。當(dāng)日下午，又陸續(xù)有2 匹狼死亡，其中1 匹狼死前抽搐，剖檢可見下頜皮下組織出血性膠樣浸潤、頜下淋巴結(jié)出血，全身臟器漿膜大面積出血。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀及病理剖檢變化初步診斷該狼群為梭菌感染引起的急性死亡。為了進(jìn)一步確定造成狼群死亡的病原菌生物學(xué)信息，本研究采集急性死亡狼心血、肝、脾、頜下淋巴結(jié)樣品，分離鑒定了一株A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌，并對其藥物敏感性、MLST 分型以及致病性進(jìn)行分析，為狼感染產(chǎn)氣莢膜梭菌的防治提供了理論依據(jù)，也為野生動物梭菌性傳染病的診斷與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源、實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑病料樣品為黑龍江省某動物園散放區(qū)急性死亡狼的心血、肝臟、脾臟及頜下淋巴結(jié)各1 份。6 周齡清潔級昆明鼠（18 g～22 g，雌性）購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。鮮血瓊脂培養(yǎng)基、強(qiáng)化梭菌鑒別瓊脂（DRCA）、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FT）、含鐵牛奶培養(yǎng)基、厭氧袋、厭氧產(chǎn)氣包等均購自青島海博生物科技有限公司；細(xì)菌生化微量鑒定管、藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DL8000 DNA Marker、pMD18-T 載體、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa 公司；PCR Master Mix 購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)將采集的心血、肝臟、脾臟及頜下淋巴結(jié)分別經(jīng)抹片、染色、鏡檢初步判定為病原菌后，將上述病料樣品分別劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基和DRCA 培養(yǎng)基，置于厭氧袋中，37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察菌落形態(tài)特征，挑取可疑菌落經(jīng)涂片染色鏡檢后純培養(yǎng)。純培養(yǎng)后的細(xì)菌接種于FT 液體培養(yǎng)基增菌，以便進(jìn)行后續(xù)的生化試驗(yàn)及毒素鑒定。

1.3 分離菌的生化鑒定將純化后的分離菌接入微量生化反應(yīng)管（葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、乳糖、木糖、甘露醇、MR、吲哚試驗(yàn)、水楊苷、含鐵牛奶培養(yǎng)基、還原性硝酸鹽試驗(yàn)及明膠液化）中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h～48 h，參照產(chǎn)品說明書判定結(jié)果。

1.4 分離菌16S rRNA 及毒素基因的PCR 擴(kuò)增及序列分析以提取的分離菌全基因組DNA 為模板，采用16S rRNA 通用引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增分離菌的16S rRNA 基因。PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞， PCR 鑒定的陽性克隆由吉林庫美生物科技公司測序，并參照梭菌屬中常見菌株的16S rRNA 序列，利用BLAST 比對分析其序列同源性和構(gòu)建進(jìn)化樹。同時(shí)參照文獻(xiàn)[10]中PCR 方法擴(kuò)增分離菌株α 毒素（cpa基因編碼）、β 毒素、B2毒素、CPE 毒素、ε 毒素、ι 毒素、NetB 毒素的基因。

1.5 分離菌的多位點(diǎn)序列分型（MLST）參照文獻(xiàn)[11]中PCR 方法擴(kuò)增產(chǎn)氣莢膜梭菌的8 個(gè)管家基因（colA-groEL-sodA-plc-gyrB-sigK-pgk-nadA），PCR 產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，利用PubMLST 數(shù)據(jù)庫（https://pubmlst.org/organisms/clostridium-perfringens）分別查找比對等位基因，確定分離菌的ST 型。

1.6 分離菌的藥敏試驗(yàn)采用K-B 紙片擴(kuò)散法檢測分離菌藥敏性。取100 μL 菌液均勻涂布于DRCA 培養(yǎng)基，將藥敏片貼于培養(yǎng)基表面后，置于厭氧袋中37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，依據(jù)CLSI 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.7 分離菌的致病性試驗(yàn)將42 只昆明鼠隨機(jī)均分為7組，將分離菌液10倍倍比稀釋后（5.21×105cfu/mL～1.52×109cfu/mL）分別按0.2 mL/只腹腔接種6 組實(shí)驗(yàn)組，對照組以0.2 mL/只腹腔接種FT 液體培養(yǎng)基。每天觀察并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察7 d。利用Karber 法計(jì)算分離菌對小鼠的LD50。無菌剖檢死亡小鼠，再次分離并鑒定致病菌，取肝臟、脾臟、腸等組織于4%多聚甲醛中固定，制作組織病理切片觀察。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果取病死狼的臟器組織抹片、染色、鏡檢，分別在心血、頜下淋巴結(jié)以及肝臟（圖1A）抹片中觀察到兩端鈍圓，單個(gè)或成短鏈排列的革蘭陽性粗大桿菌。經(jīng)鮮血瓊脂培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)后可見圓形、灰白色、有雙溶血環(huán)的菌落（圖1B）；在DRCA 培養(yǎng)基上可見圓形、黑色菌落（圖1C）。革蘭染色鏡檢可見與臟器抹片相同的菌體特征（圖1D）。分離菌的培養(yǎng)和染色特性與產(chǎn)氣莢膜梭菌相似，初步表明分離菌可能為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

圖1 狼肝臟細(xì)菌革蘭染色及分離培養(yǎng)Fig.1 Gram staining,isolation and culture of the bacteria from wolf liver tissue

2.2 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甲基紅試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)和明膠液化均呈現(xiàn)陽性，而果糖、木糖、甘露醇、吲哚試驗(yàn)和水楊苷結(jié)果呈陰性，動力試驗(yàn)呈陰性，在含鐵牛奶培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 h后大量產(chǎn)氣，呈現(xiàn)嚴(yán)重的爆裂發(fā)酵現(xiàn)象。將生化試驗(yàn)結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》對比分析后顯示，該分離菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化試驗(yàn)結(jié)果一致。進(jìn)一步表明分離菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.3 分離菌16S rRNA基因序列及毒素分型序列的測定結(jié)果以分離菌提取的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示其16S rRNA 基因與預(yù)期大?。? 421 bp）一致（圖2A）；序列分析結(jié)果顯示分離菌16S rRNA 基因序列與產(chǎn)氣莢膜梭菌相應(yīng)基因序列同源性達(dá)99%以上，但與梭菌屬中的其他菌株存在較大差異（圖2B）。進(jìn)化樹結(jié)果顯示，分離菌16S rRNA基因序列與產(chǎn)氣莢膜梭菌聚類。綜合分離菌的染色、培養(yǎng)特性和生化試驗(yàn)結(jié)果，表明分離菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌，命名為C.perfringensHLJ15-2。PCR 檢測C. perfringensHLJ15-2 的毒素基因結(jié)果顯示，僅檢測到cpa；測序分析結(jié)果顯示，該擴(kuò)增產(chǎn)物與產(chǎn)氣莢膜梭菌cpa序列同源性達(dá)99.65%。表明C.perfringensHLJ15-2毒素型為A型。

圖2 分離菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增（A）及系統(tǒng)進(jìn)化樹（B）結(jié)果Fig.2 Results of 16S rRNA gene amplification(A)and phylogenetic tree(B)of the isolate

2.4 分離菌MLST分型結(jié)果利用MLST方法對C.perfringensHLJ15-2 進(jìn)行基因分型，通過8 個(gè)管家基因colA、groEL、sodA、plc、gyrB、sigK、pgk、nadA的測序結(jié)果分析獲得各個(gè)等位基因的編號分別為74、63、1、4、25、60、1、13，進(jìn)而確定C.perfringensHLJ15-2為ST 221 型，該型菌為雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌。推測本次疫情可能為狼食用雞制品感染該菌所致。

2.5 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果C.perfringensHLJ15-2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌對磺胺類抗菌藥、喹諾酮類抗菌藥敏感；對四環(huán)素類抗生素、多肽類抗生素以及β-內(nèi)酰胺類抗生素中的頭孢拉定、氨芐西林耐藥（表1），表明C.perfringensHLJ15-2具有多重耐藥性。

表1 C.perfringens HLJ15-2的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Drug sensitivity test of the C.perfringens HLJ15-2

2.6 分離菌小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果利用昆明鼠進(jìn)行C.perfringensHLJ15-2 的致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示2.76×108cfu/mL、1.52×109cfu/mL 菌液組小鼠在感染后12 h內(nèi)全部死亡，6.30×107cfu/mL 菌液組小鼠在感染后18 h 內(nèi)死亡5 只，1.86×107cfu/mL 菌液組小鼠在感染后24 h 內(nèi)死亡2 只，其余小鼠直至7 d 未見死亡，對照組未出現(xiàn)發(fā)病和死亡情況。經(jīng)計(jì)算C. perfringensHLJ15-2 的LD50為2.26×107cfu/mL。剖檢實(shí)驗(yàn)組死亡小鼠可見腸道臌氣，黏膜出血。肝、脾輕微腫大、充血。取實(shí)驗(yàn)組小鼠肝、脾進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定，再次分離到A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

組織病理學(xué)觀察可見小鼠腸絨毛斷裂，黏膜固有層上皮細(xì)胞增生、黏膜下層紅細(xì)胞增多、充血、炎性細(xì)胞浸潤（圖3A）；肝內(nèi)各級血管淤血，肝細(xì)胞條鎖狀排列消失，體積腫大，肝細(xì)胞核濃縮、溶解，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡，部分肝細(xì)胞溶解（圖3B）；脾紅髓比例增加，白髓部分細(xì)胞壞死（圖3C）。由上述結(jié)果可見，由狼臟器內(nèi)分離的A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌對小鼠具有致病性，小鼠均在感染后24 h 內(nèi)死亡，且死亡小鼠剖檢可見與狼群感染產(chǎn)氣莢膜梭菌引起急性死亡的癥狀基本一致，表明該分離菌具有強(qiáng)致病性。

圖3 感染小鼠組織病理切片觀察Fig.3 Observation of pathological tissue sections of infected mice

3 討 論

產(chǎn)氣莢膜梭菌分布廣泛，可產(chǎn)生多種毒素，對人和動物的健康造成嚴(yán)重危害。其中僅分泌α 毒素的A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌是動物和人食源性感染的主要毒素型。有研究報(bào)道α 毒素能突破血腦屏障，侵害延髓，破壞呼吸系統(tǒng)及心臟的傳導(dǎo)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致動物“猝死癥”的發(fā)生[12-13]。本研究首次分離鑒定了一株狼源A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌，涉及的患病狼均呈急性死亡，與之前報(bào)道的野生動物急性死亡病例相似，但由于狼屬于國家二級保護(hù)野生動物，無法開展本動物致病性試驗(yàn)，因此本研究利用小鼠對分離菌進(jìn)行致病性分析，結(jié)果表明本次發(fā)生的狼急性死亡與A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染密切相關(guān)。

由于產(chǎn)氣莢膜梭菌是腸道內(nèi)的常在菌，可引起內(nèi)源性感染。為了明確本次感染的來源，對新分離的菌株進(jìn)行了MLST 分型，通過對其8 個(gè)管家基因的測序、比對，確定了其為ST 221 型，屬于雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌。ZHANG 等人報(bào)道的產(chǎn)氣莢膜梭菌引起東北虎和獅子死亡的病例中認(rèn)為高蛋白飲食及未完全解凍的雞肉是產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要來源[9]。而在以往的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，無論在雞的養(yǎng)殖還是屠宰環(huán)節(jié)，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌均是最常被分離到的毒素型。司南等從多地區(qū)采集的549 份遷徙候鳥樣品中分離鑒定了42 株產(chǎn)氣莢膜梭菌，均為A 型菌，另外從養(yǎng)雞場分離鑒定了多株產(chǎn)氣莢膜梭菌，A型菌分離率高達(dá)90%以上[14]。Li 等報(bào)道了從北京和山西地區(qū)的豬群、雞群采集的620 份糞便樣品中分離鑒定了322 株產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型均為A 型[15]。 A 型菌在禽類感染中處于主要地位。因此推測本次疫情可能與狼飼喂雞制品有關(guān)，可見給肉食動物飼喂禽類制品時(shí)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)在飼喂前明確禽制品的來源，必要時(shí)應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)的監(jiān)測，防止類似事件的發(fā)生。

關(guān)于野生動物源的產(chǎn)氣莢膜梭菌的藥敏試驗(yàn)報(bào)道較少。Silva 等報(bào)道了從野生肉食動物和鳥類分離的菌株對氟苯尼考、甲硝唑、青霉素和萬古霉素普遍敏感，對紅霉素、泰樂菌素和土霉素耐藥[16]。而本研究分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌對氟苯尼考、頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟、磺胺甲基異惡唑、阿莫西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等敏感。由MLST 分型表明，本研究分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌為雞源菌，在一些報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)雞場以及屠宰場中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌對多種抗生素耐藥，基本集中在多黏菌素、四環(huán)素、氯霉素、氨芐西林等藥物的耐藥，與本研究分離菌的耐藥性基本一致[17-18]，也進(jìn)一步印證了MLST 的分型結(jié)果。

本研究是我國首次報(bào)道狼群感染A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌與急性死亡相關(guān)的病例，分離菌株C. perfringensHLJ15-2 主要生物學(xué)特性的研究結(jié)果豐富了野生動物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的生物學(xué)信息，為該病的診斷與防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。