馬德青，張金城，徐貝貝，馮偉民，陳 鑫，韋 平，黃 騰

（廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西 南寧 530005）

傳染性喉氣管炎（Infectious laryngotracheitis，ILT）是由ILT 病毒（ILTV）感染引起雞的急性、高度接觸性上呼吸道疾病。發(fā)病雞的臨床表現(xiàn)有張口呼吸、甩頭咳出帶血粘液，眼結(jié)膜出現(xiàn)中度至重度紅腫[1]。該病具有感染性強、發(fā)病急、傳播快等特點，嚴重威脅養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展[2]。接種ILTV 減毒活疫苗是當前防控該病流行的有效措施之一，常見活疫苗類型有雞胚來源（Chicken embryo origin，CEO）和組織來源（Tissue culture origin，TCO），但長期且大范圍使用這兩種疫苗存在疫苗株毒力返強的風險，引起疫苗型ILT（Vaccinal ILT）[3]。

ILTV 在分類學上屬皰疹病毒科、α 皰疹病毒亞科，其雙鏈DNA 基因組編碼的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）在位置和結(jié)構(gòu)上與哺乳動物皰疹病毒有較高同源性[4]。UL56是α 皰疹病毒所特有的基因，編碼一種II 型跨膜蛋白UL56，該蛋白位于病毒囊膜與核衣殼之間的皮層區(qū)（Tegument）。人單純皰疹 病 毒II 型（Herpes simplex virus type 2，HSV-2）UL56 能夠促進感染細胞內(nèi)Nedd4 蛋白（Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4，Nedd4）的泛素化，使之在蛋白酶體內(nèi)降解，但UL56 的具體生物學作用尚不明確[5]。豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）UL56 與病毒的擴散和致病性增強有關(guān)[6]，而馬皰疹病毒I 型（Equine herpesvirus type 1，EHV-1）UL56 能夠阻礙感染細胞表面主要組織相容性復合體I（Major histocompatibility complex class I，MHC-I）分子的遞呈[7]。ILTV 與其他α 皰疹病毒的UL56 氨基酸序列相似，均含有PY motif 和跨膜域（TMD）關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，保守性較高，但其是否具有與其他α 皰疹病毒類似的作用尚待研究。

本研究將UL56 蛋白氨基酸序列中兩個PY motif的所有的脯氨酸（Pro，P）均突變?yōu)楸彼幔ˋla，A）；還將其TMD 刪除，分別構(gòu)建了pUL56（WT）及其突變體的真核表達質(zhì)粒pUL56（AY）、pUL56（ΔTMD）。將ILTV 分別感染雞胚腎（CEK）細胞和氣管環(huán)（TOC）后，通過western blot 檢測不同感染模式中UL56 蛋白的表達特征，并通過激光共聚焦試驗觀察UL56（WT）及其不同突變體的亞細胞定位，分析影響其亞細胞定位的關(guān)鍵區(qū)域，為解析UL56 在ILTV 致病過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料HEK293T 細胞、DF-1 細胞、pDsRed2-N1 質(zhì)粒由本實驗室保存；雞ILTV 活疫苗（K317 株，5 000 EID50/mL，JX458824.1）購自哈藥集團生物疫苗有限公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN 公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購自CWBIO 公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo Fisher 公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購自TransGen 公 司；TranslT@-LT1 Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑購自Mirus 公司；4%多聚甲醛固定液、Triton X-100、QuickBlockTM封閉液（TBS）、HRP 標記山羊抗兔或抗鼠IgG（IgG-HRP）、AlexaFluor 488 羊抗兔或抗鼠IgG 購自Beyotime 公司；鼠抗tubulin、抗HA 標簽單克隆抗體（MAb）購自Abmart 公司；5×SDS loading buffer購自Solarbio 公司；RIPA裂解液、ECL化學發(fā)光試劑盒購自NCM 公司；DMEM 購自Gibco 公司；鼠抗高爾基體58k 多克隆抗體（pAb）購自Novus Biologicals公司；兔抗ILTV UL56 多克隆抗體（pAb）為本實驗室制備，抗原多肽序列：30DPHQDDFPRDADSPN44。

1.2 表達UL56 及其突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定根據(jù)基因序列（AGN48313.1）設(shè)計上游引物UL56 F： 5′- TCAAGCTTGCCACCATGTCTTCAGAGGACACA TC-3′/下游引物UL56 R：5′-CAGAATTCTAGCGTAGTCT GGGACGTCGTATGGGTATCCCGGAGTC-3′，提 取ILTV疫苗株K317的基因組DNA作為模板，利用上述引物經(jīng)PCR擴增UL56基因及HA標簽（共862 bp），經(jīng)Hind III/EcoR I雙酶切后克隆至pDsRed2-N1載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUL56（WT）。利用UniProt、IEDB等在線蛋白分析軟件分析UL56蛋白關(guān)鍵氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域分布（圖1A），分別將UL56 蛋白氨基酸序列中2 個PY motif（PPPY、PPSY）的所有P 均突變?yōu)锳，并由武漢金開瑞生物工程有限公司合成編碼突變體的基因及HA 標簽（共855 bp），引入NheI/Hind III酶切位點并克隆至pDsRed2-N1 載體，構(gòu)建突變體質(zhì)粒pUL56（AY）（圖1B）。采用同樣方法合成無TMD 序列的UL56基因及HA 標簽（共793 bp），引入Hind III/EcoR I 酶切位點并克隆至pDsRed2-N1 載體，構(gòu)建突變體質(zhì)粒pUL56（ΔTMD）（圖1B）。以上3個重組質(zhì)粒均采用酶切方法鑒定。

圖1 ILTV UL56氨基酸序列（A）、pUL56（WT）及其突變體質(zhì)粒（B）的構(gòu)建Fig.1 The amino acid sequence of ILTV UL56(A)and the construction of pUL56(WT)and its mutants(B)

1.3 UL56 及其突變體瞬時表達的western blot 鑒定利用轉(zhuǎn)染試劑盒將2 μg 重組質(zhì)粒pUL56（WT）、pUL56（AY）、pUL56（ΔTMD）分別轉(zhuǎn)染6 孔板中的DF-1 細胞，pDsRed2-N1 轉(zhuǎn)染的DF-1 細胞作為陰性對照。48 h后收獲細胞，加入200 μL RIPA 裂解液（含蛋白酶、磷酸酶抑制劑）冰浴30 min裂解細胞后，離心取上清，加入5×SDS loading buffer，95 ℃10 min 后，分別以兔抗UL56 pAb、鼠抗HA、鼠抗tubulin MAb（1∶5 000）為一抗，分別以山羊抗兔和抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，通過western blot 檢測UL56（WT）及其突變體UL56（AY）、UL56（ΔTMD）的表達。

1.4 ILTV K317 株感染雞胚腎細胞（CEK）、氣管環(huán)（TOC）后UL56 表達特征的western blot 檢測取20日齡SPF 雞胚，參照文獻[8]方法制備TOC，并以25個環(huán)/孔培養(yǎng)于含3% DMEM 培養(yǎng)基的12 孔板中培養(yǎng)。同時參照文獻[9]制備CEK 細胞，并于含5%FBS DMEM 培養(yǎng)基的6 孔板中培養(yǎng)；待CEK 細胞長至密度為70%～80%單層、TOC 培養(yǎng)48 h 后，將5 000 EID50/mL ILTV K317 株分別接種CEK 細胞及TOC，同時以不感染病毒的CEK 細胞和TOC 為陰性對照。CEK 細胞置37 ℃孵育2 h、TOC 孵育24 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS 洗3 次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，同時在接種病毒后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 收獲CEK 細胞及氣管環(huán)TOC。TOC 經(jīng)液氮研磨后，再分別以200 μL RIPA 裂解液裂解細胞和TOC，冰 浴30 min 后，參 照1.3 的western blot 鑒 定UL56 蛋白在上述兩種感染體系中的表達特征。

1.5 UL56 及其突變體亞細胞定位的激光共聚焦試驗將1 μg 重組質(zhì)粒pUL56（WT）、pUL56（AY）、pUL56（ΔTMD）分別轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，以空載體pDsRed2-N1 轉(zhuǎn)染的HEK293T 細胞為陰性對照。48 h 后棄細胞培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定細胞10 min，在含0.1% Triton X-100 的PBS 中處理20 min，Quick-BlockTM封閉液（TBS）封閉10 min；加入高爾基體58k抗體（1∶100）為一抗， 再以Alexa Fluor 488 標記的羊抗鼠IgG（1∶500）為二抗，室溫孵育1 h 后加入含DAPI 染料的緩沖液，室溫作用20 min。利用激光共聚焦顯微鏡觀察并分析UL56（WT）、UL56（AY）、UL56（ΔTMD）的亞細胞定位。

2 結(jié) 果

2.1 pUL56 及其突變體真核表達載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUL56（WT）、pUL56（AY）、pUL56（ΔTMD）分別采用HindⅢ/EcoR I、NheI/Hind III、Hind III/EcoR I 雙酶切，分別得到862 bp、855 bp 和793 bp 的目的片段，而pDsRed2-N1 空載體經(jīng)上述酶切僅得到一條約4 600 bp（圖2），與預期結(jié)果一致。將各質(zhì)粒測序并利用SnapGene 軟件比對測序結(jié)果，結(jié)果顯示插入片段與設(shè)計并合成的目的基因序列完全一致，表明重組質(zhì)粒pUL56（WT）及其突變體質(zhì)粒pUL56（AY）、pUL56（ΔTMD）正確構(gòu)建。

圖2 重組質(zhì)粒pUL56（A）及其突變體質(zhì)粒pUL56（AY）（B）、pUL56（ΔTMD）（C）的酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Digestion identification of recombinant plasmids pUL56(A)and its mutants plasmids pUL56(AY)(B),pUL56(（ΔTMD)(C)digestion identification results

2.2 UL56 及其突變體表達的western blot 鑒定結(jié)果將重組質(zhì)粒pUL56（WT）、pUL56（AY）、pUL56（ΔTMD）分別轉(zhuǎn)染DF-1細胞，48 h后收獲細胞裂解處理后經(jīng)western blot鑒定。結(jié)果顯示，采用UL56 pAb及HA MAb分別作為一抗均能檢測到一條約81 ku的特異性條帶（圖3），而UL56 理論預測值為57.4 ku，推測UL56 可能形成了二聚體或存在翻譯后修飾。以上結(jié)果表明，UL56（WT）及其突變體UL56（AY）、UL56（ΔTMD）均在DF-1 細胞中獲得了瞬時表達。

圖3 pUL56及其突變體在DF-1細胞中瞬時表達的western blot鑒定Fig.3 Western blot identification of transient expression of pUL56 and its mutants in DF-1 cells

2.3 ILTV K317 株感染CEK、TOC 后UL56 表達規(guī)律的western blot 鑒定結(jié)果利用ILTV K317 株以5 000 EID50/mL 的劑量分別感染CEK 細胞及氣管環(huán)TOC 后，收集不同感染時間點的細胞及氣管環(huán)提取總蛋白，通過western blot 檢測UL56 的表達規(guī)律。結(jié)果顯示， UL56 在CEK 中的分子量約為84 ku，從感染后24 h 開始表達，48 h 達到峰值，隨后逐漸降低，但降低并不明顯（圖4A）。UL56 在TOC 中的分子量約為104 ku，于感染后24 h 開始表達，此后表達量持續(xù)升高，至96 h 達到峰值；陰性對照組均無相應(yīng)條帶（圖4B）。表明UL56 在ILTV 感染的CEK 細胞和TOC 均有表達，且其在這兩種感染體系中的表達規(guī)律并不一致。

圖4 ILTV感染后雞胚腎細胞（CEK）（A）和氣管環(huán)（TOC）（B）UL56蛋白表達的western blot鑒定結(jié)果Fig.4 Detection of the expression for UL56 protein in infectedchicken embryo kidney(CEK)cells(A)and tracheal organ cultures(TOC)(B)after ILTV infection by western blot

2.4 UL56 及其突變體亞細胞定位的檢測結(jié)果將重組質(zhì)粒pUL56（WT）、pUL56（AY）、pUL56（ΔTMD）瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，48 h 后以高爾基體58k 抗體為一抗，再加入相應(yīng)二抗后利用激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，空載體pDsRed2-N1 轉(zhuǎn)染的細胞中，紅色熒光充滿整個細胞。野生型UL56 和突變體UL56（AY）均定位于細胞質(zhì)的核周區(qū)域，且二者的熒光信號均與高爾基體標記蛋白有重疊，呈黃色的斑塊狀分布，表明UL56（WT）與UL56（AY）均定位于高爾基體。刪除TMD 后，突變體UL56（ΔTMD）從細胞質(zhì)向細胞核內(nèi)聚集（圖5）。上述結(jié)果表明PY 基序不影響UL56 的定位，而TMD 則對其在細胞中的定位起決定性作用。

圖5 UL56（WT）及其突變體UL56（AY）、UL56（ΔTMD）亞細胞定位的激光共聚焦試驗結(jié)果Fig.5 Subcellular localization of UL56(WT),its mutants UL56(AY)and UL56(ΔTMD)by laser confocal analysis

3 討 論

哺乳動物α 皰疹病毒UL56 與宿主細胞存在復雜的相互作用并發(fā)揮廣泛的生物學功能。HSV-2 UL56與胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運和病毒粒子釋放有關(guān)[10]，并能增強病毒的致病性[11]。PRV UL56 能夠促進病毒的神經(jīng)致病性[12]，并通過下調(diào)高爾基體相關(guān)蛋白Rab6a 的表達，導致高爾基體碎片化，從而調(diào)節(jié)病毒粒子的組裝[13]。EHV UL56 干擾樹突狀細胞表面免疫分子的表達，介導CD83 和CD86 的部分下調(diào)表達[14]。EHV UL56 還可以促使細胞表面MHC-I 分子進入動力蛋白（Dynamin）依賴的內(nèi)吞途徑，并最終被溶酶體降解[15]。然而，ILTV UL56 在感染細胞或動物中發(fā)揮的作用未見報道。

研究表明ILTV 感染后UL56 可以發(fā)生磷酸化，western blot 檢測哺乳動物HSV-2、EHV-1 感染的細胞樣品，結(jié)果顯示UL56 均存在2 條特異性條帶，利用Lambda 蛋白磷酸酶處理后分子量較大的條帶消失[7]。但本研究中ILTV UL56 則無該現(xiàn)象，無論在感染還是轉(zhuǎn)染條件下其均呈單一條帶，這提示UL56 蛋白磷酸化可能只發(fā)生在特定的病毒與宿主的互作過程，這也是本研究中ILTV UL56 蛋白表達的獨特之處。本研究對比了兩種不同感染模型下ILTV UL56的表達差異，結(jié)果顯示感染后48 h 原代CEK 細胞中UL56 的表達量最高，而在離體組織TOC 中UL56 表達量的峰值則出現(xiàn)在感染后96 h，且特異性條帶的分子量相差20 ku，由此推測ILTVUL56基因可能存在組織特異性的可變剪接轉(zhuǎn)錄本或蛋白翻譯后修飾，導致其在不同組織中的表達規(guī)律出現(xiàn)較大差異。

UL56 蛋白家族的長親水區(qū)域有1～3 個特征性的氨基酸motif，依次由脯氨酸（Pro）、脯氨酸（Pro）、任意氨基酸（x）和酪氨酸組成（Tyr），即PPxY（下稱PY motif）。PY motif 被破壞后， UL56 突變體無法結(jié)合含WW 結(jié)構(gòu)域的Nedd4 蛋白[5]。HSV-2 和PRV UL56 的PY motif 均影響Nedd4 蛋白的細胞定位[12,16]，且PY motif 的數(shù)量與UL56 和宿主蛋白互作的能力呈正相關(guān)[17]。本研究經(jīng)序列分析顯示ILTV UL56 氨基酸序列含2 個PY motif（圖1A），理論上其應(yīng)該能與Nedd4 或其他含WW 結(jié)構(gòu)域的宿主蛋白發(fā)生相互作用，但這種假設(shè)是否成立后續(xù)將通過免疫共沉淀試驗及蛋白質(zhì)譜檢測驗證。

本研究分別構(gòu)建了UL56 及其突變體的真核表達質(zhì)粒，并分析UL56 蛋白的亞細胞定位及影響亞細胞定位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示UL56 蛋白定位于高爾基體，PY motif 對其定位無明顯影響，而TMD 對其的亞細胞定位至關(guān)重要，說明UL56 蛋白家族的亞細胞定位高度保守。雖然目前的研究一致認為完整的UL56 蛋白定位在高爾基體，但刪除TMD 的突變體UL56（ΔTMD）存在不同的亞細胞定位。在轉(zhuǎn)染條件下，本研究結(jié)果與HSV-2 UL56（ΔTMD）的亞細胞定位基本一致[18]，均定位于細胞核。推測這可能是由于TMD 刪除后UL56 內(nèi)部的堿性氨基酸富集區(qū)暴露，形成核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）致突變體進入細胞核；而在感染條件下，EHV-1 UL56（ΔTMD）則大量存在于細胞漿[7]。這兩種截然不同的定位結(jié)果提示可能有其他病毒蛋白與UL56 結(jié)合，使之成為病毒粒子的一部分。

由于本研究所使用的ILTV 商品化活疫苗K317 株為雞胚來源（Chicken embryo-origin），且尚未在傳代易感細胞系LMH（Leghorn male hepatoma）中適應(yīng)，所以無法在感染條件下研究UL56 蛋白的表達和定位。此外，目前商品化的細胞器抗體產(chǎn)品針對的物種大多為哺乳動物，這些抗體無論在雞原代CEF 細胞，還是DF-1 和LMH 細胞系中，均很難產(chǎn)生特異性的信號，因此只能通過轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞來研究UL56蛋白的亞細胞定位。解決這些實驗材料和方法的局限性是后續(xù)研究ILTV UL56 蛋白生物學功能的關(guān)鍵。

綜上所述，本研究通過檢測ILTV UL56 蛋白在兩種感染模式下的表達差異，首次發(fā)現(xiàn)了該蛋白具有獨特的表達特征，明顯有別于其他動物α 皰疹病毒UL56 蛋白的表達特征，這些現(xiàn)象與ILTV UL56 的生物學功能是否存在關(guān)聯(lián)需要進一步研究。本研究拓寬了對ILTV UL56 蛋白表達的認知，為其生物學功能的研究奠定了一定實驗基礎(chǔ)。