席 飛，皇甫皓月，黃煉榆，王可欣，沈冬冬，張紀(jì)文，張振江，李 芳，趙東明

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種由ASF 病毒（ASFV）引起豬的傳染性病毒病，死亡率可達100%[1]。該疾病于1921 年在肯尼亞首次被發(fā)現(xiàn)[2]，并于2018 年在我國遼寧省沈陽市被發(fā)現(xiàn)[3]，隨后在全國快速流行，目前尚無針對該疾病有效的抗病毒藥物及疫苗，嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[4]，針對ASFV的抗病毒藥物及有效的疫苗研發(fā)顯得尤為重要。

ASFV 是一種單分子線狀DNA 病毒，屬于雙鏈DNA 病毒目非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus），也是Asfarviridae家族（Asfivirus屬）的唯一成員[5]。ASFV 基因組非常龐大，約170 kb～190 kb，含150 多個開放閱讀框[6]（ORFs），病毒結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜[7]?；谠擙嫶蟮幕蚪M，ASFV能夠編碼許多功能蛋白供其完成某些生命周期活動。例如，ASFV 可以編碼與病毒基因組復(fù)制相關(guān)的蛋白[8]。已有研究表明，ASFV 基因組中G1211R、E301R、F1055L、P1192R、C962R等基因編碼的蛋白為ASFV 基因組復(fù)制相關(guān)蛋白[9]。其中，C962R 蛋白類似于彩虹病毒中的引物酶家族成員，能夠融合至D5 樣解旋酶結(jié)構(gòu)域[10]，具有解開DNA 雙螺旋及形成DNA 復(fù)制階段所需RNA 引物的作用[11]，C962R基因在不同ASFV 分離株中均高度保守[12]。引物解旋酶是ASFV 基因組復(fù)制過程中和DNA 合成過程中重要的功能蛋白，并能與DNA 聚合酶亞基相互作用及形成蛋白復(fù)合物，探究與C962R蛋白互作的病毒蛋白將有助于揭示C962R 蛋白的生物學(xué)功能和了解與ASFV 基因組復(fù)制相關(guān)的功能性復(fù)合體的組成和分子機理。

為分析ASFV引物解旋酶C962R基因的動態(tài)轉(zhuǎn)錄水平及探尋與其互作的病毒蛋白，本研究利用熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測ASFV Pig/HLJ/2018株感染豬肺泡巨噬細胞（PAM）后不同時間C962R基因的轉(zhuǎn)錄水平，并構(gòu)建融合表達C962R 和Strep 標(biāo)簽的重組ASFV 及表達C962R蛋白的細胞，通過質(zhì)譜分析及免疫共沉淀試驗確定與C962R蛋白互作的病毒蛋白，為以C962R蛋白為靶蛋白的新型抗ASFV藥物及疫苗的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料ASFV Pig/HLJ/2018 株、ASFV 基因組、HEK293T細胞、PAM、PK-15細胞、pCAGGS載體、表達C962R 蛋白和Strep 標(biāo)簽的慢病毒包裝質(zhì)粒LentiGuide-puro-962-Strep、慢病毒包裝輔助質(zhì)粒pVSVG、pPSPA、攜帶有mCherry基因的質(zhì)粒pmCherry、pCAGGS-C962R-Strep 質(zhì)粒、同源重組轉(zhuǎn)染試劑K2M、K2 由本實驗室保存；p3X-MCS 載體由pMD18-T 質(zhì)粒改造構(gòu)建，并保存在本實驗室；E. coliDH5α 感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；轉(zhuǎn)染試劑TransIT-Lenti 購自Mirus 公司；鼠源Strep 抗體、鼠源Flag 抗體、山羊抗小鼠IgG-HRP 及脫硫生物素（D-Desthiobiotin）均購自Sigma公司；Strep-Tactin?Sepherose 購自IBA 公司；OPTI-MEM 購自Gibco 公司；蛋白上樣緩沖液、poly brene 購自Solarbio 公司；預(yù)染蛋白Maker、T4連接酶購自Thermofisher scientific公司。

本研究所涉及到的ASFV 操作均在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家動物疫病防控高級別生物安全實驗室完成。

1.2 引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank 中ASFV Pig/HLJ/2018 株基因組序列（MK333180.1），利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，并在上下游引物5′端分別引入相應(yīng)酶切位點，引物均由吉林庫美生物科技有限公司合成（表1）。

表1 本研究所需引物Table 1 Primers of the study

1.3 ASFVC962R基因轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)分析將ASFV Pig/HLJ/2018 株以MOI 10 感染PAM，感染后的0～20 h 內(nèi)每間隔2 h 收獲細胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用C962R基因引物C962R-F/C962R-R，內(nèi)參引物DNAJC14-F/DNAJC14-R 經(jīng)RT-qPCR 擴增C962R基因和內(nèi)參基因DNAJC14，每組設(shè)置3 個重復(fù)，DEPC 水作為陰性對照。將RT-qPCR 的結(jié)果用2-ΔΔCt（Ct 目的基因-Ct 內(nèi)參基因=ΔCt；ΔCt 處理樣品-ΔCt 對照樣品=ΔΔCt）法處理，分析C962R基因轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以ASFV 基因組為模板，利用引物Upstream-F/R 經(jīng)PCR 擴增距C962R基因起始密碼子41 bp（內(nèi)含子部分）處上游約1 000 bp的基因序列，得到Upstream片段，克隆至質(zhì)粒p3X-MCS中， 構(gòu)建重組質(zhì)粒p3X-MCS-Upstream；以質(zhì)粒pm-Cherry 為模板，利用引物mCherry-F/R 擴增mCherry片段并克隆至p3X-MCS-Upstream 質(zhì)粒中構(gòu)建重組質(zhì)粒p3X-MCS-Upstream-mCherry；以ASFV 基因組為模板，利用引物Downstream-Strep-F/R、Downstream-41-F/R經(jīng)PCR 擴增C962RN 端約1 000 bp 的基因序列（該N端融合Strep 標(biāo)簽）及C962R基因起始密碼子上游的41 bp（內(nèi)含子部分）基因序列，分別克隆至p3X-MCSUpstream-mCherry 質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒p3X-MCSC962R-mCherry，經(jīng)雙酶切（NdeI/Hind III）和測序鑒定。

1.5 表達C962R 蛋白融合Strep 標(biāo)簽的重組ASFV的構(gòu)建與鑒定將PAM 以3×106個/孔鋪于六孔細胞板中，24 h 后，每孔加入40 μL K2M 試劑；1.5 h后，分別配置A 液：130 μL 1640 培養(yǎng)基+10 μL K2試劑；B 液：130 μL 1640 培養(yǎng)基+3 μg p3X-MCSC962R-mCherry 質(zhì)粒，將A 液和B 液混合，室溫下放置10 min 后轉(zhuǎn)染PAM。24 h 后，將ASFV Pig/HLJ/2018 株以MOI 1 感染PAM，48 h 后分別收獲細胞與上清液。將收獲的含重組ASFV 的上清液以MOI 1 感染PAM，24 h 后，分別收獲上清液和PAM。提取細胞上清中的病毒基因組，利用引物962-F/962-R 擴增含mCherry融合Strep 標(biāo)簽的基因片段，并由庫美公司測序；利用細胞裂解液（1 mmol/L Tris-HCl pH7.3，2.5 mmol/L NaCl，10% NP-40，20 mmol/L EDTA）裂解PAM，離心后取上清，以鼠源Strep 抗體（1∶1 000）為一抗、山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測重組ASFV（rC962R-mCherry），以感染ASFV Pig/HLJ/2018 株的PAM 作為陰性對照。

1.6 表達C962R 蛋白的PK 15 細胞（PK-15-962-Strep）的構(gòu)建與鑒定將HEK293T細胞以4×106個/孔鋪于六孔板中，24 h 后將慢病毒包裝質(zhì)粒LentiGuidepuro-962-Strep、輔助質(zhì)粒pVSVG、pPSPA 共同溶于OPTI-MEM 中；另將轉(zhuǎn)染試劑TransIT-Lenti 與OPTIMEM 混合，孵育5 min 后將上述兩種混合液混合，室溫孵育30 min后轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，48 h后收獲含慢病毒的細胞上清。將PK-15 細胞以3×106個/孔鋪于六孔板中，將慢病毒按照1/2 細胞培養(yǎng)液體積轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞中，每孔加入1.1 μL poly brene 試劑，以正常PK-15 細胞作為空白對照。轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h 后，利用嘌呤霉素（1 μg/mL）篩選，直至空白對照組的細胞全部死亡，收獲存活的細胞。利用1.5 中的western blot 方法，檢測獲得的細胞中C962R 蛋白的表達，以正常PK-15細胞作為空白對照。

1.7 與ASFV C962R 蛋白互作病毒蛋白的Strep pull-down 試驗分別利用構(gòu)建的重組ASFV rC962RmCherry 和PK-15-962-Strep 細胞檢測與ASFV C962R蛋白互作的病毒蛋白。前者：將重組ASFV rC962RmCherry 以MOI 1 感染PAM 作為實驗組，以Pig/HLJ/2018 株感染PAM 作為陽性對照，正常PAM 作為空白對照。后者：將Pig/HLJ/2018 株以MOI 1 感染細胞PK-15-962-Strep 作為實驗組，以PK-15-962-Strep細胞作為陽性對照，正常的PK-15 細胞作為空白對照。每組感染24 h 后，分別裂解細胞，離心取上清，并與Strep-Tactin?Sepherose 于4 ℃低速共孵育2 h 后，進行Strep pull-down 試驗，以鼠源Strep 抗體（1∶1 000）為一抗、山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測洗脫液中的C962R 蛋白及與其互作的病毒蛋白。將獲得的洗脫液由中科院生物物理所質(zhì)譜中心經(jīng)質(zhì)譜鑒定C962R 蛋白及與其互作的病毒蛋白。

1.8 與ASFV C962R 蛋白互作的病毒蛋白的Co-IP驗證以ASFV 基因組為模板，利用表1 中的引物A137R-F/A137R-R、K145R-F/K145R-R、K205R-F/K205R-R 經(jīng)PCR 擴增由1.7 質(zhì)譜鑒定到的病毒蛋白編碼基因，并分別通過PCR 融合Strep 標(biāo)簽于各基因的C 端，將擴增得到的基因片段分別克隆至pCAGGS 載體中，經(jīng)雙酶切（SacI/NheI）鑒定為陽性的質(zhì)粒由庫美生物科技有限公司測序，正確的質(zhì)粒分別命名為：pCAGGS-A137R-Flag、pCAGGS-K145R-Flag、pCAGGSK205R-Flag。將HEK293T 細胞鋪于六孔細胞板中，當(dāng)細胞融合度達到80%～90%時，將質(zhì)粒pCAGGSA137R-Flag+pCAGGS-C962R-Strep、pCAGGS-K145RFlag+pCAGGS-C962R-Strep、pCAGGS-K205R-Flag+pCAGGS-C962R-Strep 利 用 轉(zhuǎn) 染 試 劑TransIT-Lenti 分別轉(zhuǎn)染至HEK293T 細胞中，單獨分別轉(zhuǎn)染pCAGGSA137R-Flag、pCAGGS-K145R-Flag、pCAGGS-K205RFlag 的HEK293T 細胞作為對照。36 h 后裂解細胞離心后取上清，取部分上清作為Input 對照。將剩余的上清與Strep-Tactin?Sepherose 在4 ℃搖床中共孵育5 h 后，利用細胞裂解液清洗Strep-Tactin?Sepherose 5 次，最后加入2×蛋白上樣緩沖液于沸水中煮樣得到IP 樣品，分別以1∶1 000 稀釋的鼠源Strep 抗體與鼠源Flag 抗體為一抗，以1∶10 000稀釋的山羊抗小鼠IgG-HRP 為二抗，對Input 樣品及IP 樣品經(jīng)western blot 驗證1.7 獲得的與ASFV C962R 蛋白互作的病毒蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 ASFV C962R 轉(zhuǎn)錄水平動態(tài)變化的檢測結(jié)果將ASFV Pig/HLJ/2018 株感染PAM，感染后0～20 h 內(nèi)每間隔2 h 取細胞，利用染料法RT-qPCR 檢測細胞中C962R基因轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化。結(jié)果顯示，感染病毒后6 h 能夠檢測到C962R基因的轉(zhuǎn)錄，隨著感染時間的延長，C962R基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，并在感染后18 h 達到峰值（圖1）。陰性對照未檢測該基因的轉(zhuǎn)錄，所以未展示該數(shù)據(jù)。結(jié)果表明C962R基因為ASFV 晚期轉(zhuǎn)錄基因，且其轉(zhuǎn)錄水平在一定的時間內(nèi)與感染時間成正相關(guān)。

圖1 ASFV C962R基因轉(zhuǎn)錄水平動態(tài)變化的RT-qPCR檢測結(jié)果Fig.1 Detection of dynamic changes of transcript level of ASFV C962R gene by RT-qPCR

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果分別以ASFV 基因組及pmCherry 質(zhì)粒為模板，利用PCR 分別擴增相應(yīng)基因片段，并依次克隆至p3X-MCS 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒p3X-MCS-C962R-mCherry。該重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果顯示，獲得大小分別為2 741 bp 和2 494 bp（載體）的片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示，插入基因序列正確。表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒p3X-MCS-C962R-mCherry。

圖2 重組質(zhì)粒p3X-MCS-C962R-mCherry的酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmid p3X-MCSC962R-mCherry by enzyme digestion

2.3 表達C962R 蛋白融合Strep 標(biāo)簽的重組ASFV的構(gòu)建與鑒定結(jié)果將重組質(zhì)粒p3X-MCS-C962RmCherry 轉(zhuǎn)染PAM，24 h 后將ASFV Pig/HLJ/2018 株感染該PAM，48 h 后收獲融合表達C962R 和Strep 標(biāo)簽的重組ASFV，并以MOI 1感染PAM，24 h后，分別收獲上清和細胞，利用PCR 擴增上清中含mCherry及Strep 標(biāo)簽的融合基因序列并測序鑒定；收獲的PAM裂解后經(jīng)western blot 檢測C962R 蛋白的表達。PCR 結(jié)果顯示，擴增出一條約1 000 bp 的目的條帶，測序結(jié)果與預(yù)期基因序列相符（圖略）；Western blot 結(jié)果顯示，PAM裂解液離心后的上清中出現(xiàn)100 ku的特異性條帶，而對照組無該特異性條帶（圖3）。上述結(jié)果表明，獲得了融合表達C962R 蛋白和Strep 標(biāo)簽的重組ASFV（rC962R-mCherry）。

圖3 重組病毒C962R-mCherry的western blot鑒定結(jié)果Fig.3 Detection of rC962R-mCherry by western blot

2.4 表達C962R 蛋白的PK-15 細胞的構(gòu)建與鑒定結(jié)果分別將慢病毒包裝質(zhì)粒LentiGuide-puro-962-Strep、輔助質(zhì)粒pVSVG、pPSPA 轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞48 h 后收獲含慢病毒的上清液，并轉(zhuǎn)導(dǎo)至PK-15 細胞中48 h 后，利用嘌呤霉素篩選融合表達C962R 蛋白和Strep 標(biāo)簽蛋白的細胞并經(jīng)western blot 鑒定。結(jié)果顯示，裂解細胞并離心后的上清液中出現(xiàn)100 ku的特異性條帶，而未轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒的PK-15 細胞無該特異性條帶（圖4）。表明獲得了表達ASFV C962R 蛋白的細胞PK-15-962-Strep。

圖4 表達C962R蛋白的細胞的western blot鑒定結(jié)果Fig.4 Detection of cells that expressing C962R protein by western blot

2.5 與ASFV C962R 蛋白互作病毒蛋白的Strep pull-down 試驗結(jié)果將rC962R-mCherry 感染PAM，同時將ASFV Pig/HLJ/2018 株感染PK-15-962-Strep，分別通過這兩種方式經(jīng)Strep pull-down 試驗檢測C962R 蛋白及篩選與其互作的病毒蛋白。結(jié)果顯示，rC962R-mCherry 感染的PAM、Pig/HLJ/2018 株感染的細胞PK-15-962-Strep 以及無病毒感染的空白細胞PK-15-962-Strep 的洗脫液中均出現(xiàn)100 ku 的特異性條帶（圖5）。將每組的洗脫液經(jīng)質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示分別利用rC962R-mCherry 及表達C962R 蛋白的細胞PK-15-962-Strep 共篩選出3 種相同的病毒蛋白：A137R 蛋白、K145R 蛋白及K205R 蛋白。結(jié)果表明，C962R 蛋白在rC962R-mCherry 感染的PAM、Pig/HLJ/2018 株感染的細胞PK-15-962-Strep 以及無病毒感染的空白細胞PK-15-962-Strep中均獲得了表達，且初步鑒定了與C962R蛋白互作的ASFV蛋白：A137R蛋白（～16.1 ku）、K145R 蛋白（～17.2 ku）、K205R 蛋白（～23.7 ku）。

圖5 分別利用rC962R-mCherry（A）及PK-15-962-Strep（B）鑒定與ASFV C962R蛋白互作病毒蛋白的Strep pull-down試驗結(jié)果Fig.5 Strep pull-down results of viral proteins interacting with ASFV C962R protein by using rC962R-mCherry and PK-15-962-Strep

2.6 與ASFV C962R 蛋白互作病毒蛋白的Co-IP 試驗結(jié)果經(jīng)PCR 分別融合Strep 標(biāo)簽于篩選出的3 種病毒蛋白編碼基因A137R、K145R及K205R的C 端，并分別克隆至pCAGGS 載體中，獲得表達A137R、K145R 和K205R 的重組質(zhì)粒。并將這3 種質(zhì)粒分別與pCAGGS-C962R-Strep 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，36 h 后裂解細胞離心后取上清采用Co-IP 試驗驗證與ASFV C962R 蛋白互作的病毒蛋白。結(jié)果顯示，利用鼠源Strep 抗體與鼠源Flag 抗體分別作為一抗時，Input 樣品中均可以檢測到各轉(zhuǎn)染組分蛋白的表達；IP 樣品中，利用Strep 抗體可以在實驗組中檢測到100 ku 的特異性條帶，對照組中則無該特異性條帶，利用Flag 抗體可以檢測到約16 ku 及17 ku 的特異性條帶（圖6），根據(jù)條帶大小，上述特異性條帶分別對應(yīng)A137R、K145R 蛋白。上述結(jié)果表明在實驗組中可以檢測到C962R 蛋白的表達，且A137R、K145R 蛋白與C962R 蛋白均存在相互作用。

圖6 與ASFV C962R蛋白互作病毒蛋白的Co-IP試驗結(jié)果Fig.6 Co-IP results y of viral proteins interacting with ASFV C962R protein

3 討 論

在病毒的生命周期中，其基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，ASFV 編碼與病毒基因組復(fù)制相關(guān)的蛋白。Linda總結(jié)歸納了與ASFV 基因組復(fù)制相關(guān)的蛋白，分別為：G1211R、E301R、C962R、F1055L、P1192R、NP419L 蛋白[9]。其中，C962R 蛋白作為引物解旋酶，具有解開ASFV DNA 雙鏈及形成RNA 引物的作用[11]，該蛋白是DNA 聚合酶功能性復(fù)合體的重要組成部分，并與其亞基存在相互作用，找到與C962R 蛋白互作的病毒蛋白有利于揭示C962R 蛋白的功能及了解與ASFV 基因組復(fù)制相關(guān)的功能性復(fù)合體的組成。

本研究首先利用ASFV Pig/HLJ/2018 株感染PAM，通過染料法RT-qPCR 檢測了C962R基因的動態(tài)轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，在感染后6 h 能夠明顯地檢測到C962R基因的轉(zhuǎn)錄，在感染后18 h 其轉(zhuǎn)錄水平達到峰值。表明C962R為ASFV 晚期轉(zhuǎn)錄基因，其轉(zhuǎn)錄水平在一定的時間內(nèi)與感染時間成正比。已有研究顯示，DNA 復(fù)制所需的酶在ASFV 從未被包膜的核心粒子進入細胞質(zhì)后立即表達，即在其基因組復(fù)制前的轉(zhuǎn)錄翻譯過程中表達，也即約在感染宿主后6 h ASFV 基因組開始復(fù)制，說明與ASFV DNA復(fù)制所需的酶需要在0～6 h之前轉(zhuǎn)錄，本研究結(jié)果均與之相符[12]。

本研究利用Strep pull-down 試驗篩選到3 種與ASFV C962R 蛋白互作的病毒蛋白：A137R 蛋白、K145R 蛋白、K205R 蛋白。進一步利用Co-IP 試驗驗證C962R 蛋白與這3 種蛋白是否具有相互作用，結(jié)果顯示，只有A137R、K145R 蛋白與C962R 蛋白有相互作用，由此推測A137R、K145R 蛋白可能通過與C962R 蛋白的相互作用影響ASFV 基因組的復(fù)制。已有研究表明，敲除A137R基因后可以抑制ASFV 的復(fù)制及降低病毒毒力[13]，說明在ASFV 基因組復(fù)制過程中，A137R可能具有不可替代的作用。而敲除K145R基因后卻對ASFV的復(fù)制及毒力無太大影響[14]。但有相關(guān)研究表明，共敲除ASFV Georgia 2007/1 株的MGF360-12L和K145R基因后，明顯降低了ASFV 在巨噬細胞中的復(fù)制水平，說明K145R 蛋白可能為ASFV 基因組復(fù)制過程中的輔助因子。此外，敲除ASFV Georgia 2007/1 株中的K145R和DP148R能夠延遲感染豬出現(xiàn)臨床癥狀的時間，說明K145R對病毒的毒力也有一定的影響。A137R 蛋白、K145R 蛋白在ASFV 中的具體作用及其作用機制還有待進一步的研究。

綜上所述，ASFV 引物解旋酶C962R 為晚期轉(zhuǎn)錄蛋白，病毒蛋白A173R、K145R 與其存在相互作用，該類復(fù)合體可能參與病毒基因組的復(fù)制階段。本研究結(jié)果有助于了解與ASFV 基因組復(fù)制相關(guān)病毒蛋白分子的組成及ASFV 基因組復(fù)制的相關(guān)機制，為以C962R 蛋白為靶蛋白的新型抗病毒藥物及疫苗的研發(fā)提供參考依據(jù)。