馬志剛，何 琴，施晨陽，劉馨博，郭雪萍，吳 靜，馬英才，蘇戰(zhàn)強(qiáng)，鐘 旗，姚 剛，馬雪連*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830052）

牛諾如病毒（Bovine norovirus，BNoV）屬于杯狀病毒科，為無包膜單股正鏈RNA 病毒，呈20 面體結(jié)構(gòu)，直徑為27 nm～40 nm。BNoV 常感染犢牛，使其出現(xiàn)非出血性腸炎、吸附不良性腹瀉、食欲下降及木糖吸收不良等臨床癥狀，并伴有腸道病變，如萎縮性空腸炎，最終造成犢牛死亡[1]。目前GenBank中有5 個(gè)NoV 基因型，BNoV 屬GIII 型，其有GIII.1、GIII.2 和GIII.3 等3 個(gè)基因型，該病毒基因組中有3個(gè)閱讀框（Open reading frame，ORF），其中ORF1 編碼P48、NTPase、P22、VPg、Pro 和RdRp，均為非結(jié)構(gòu)蛋白[2]；ORF2 編碼主要衣殼蛋白，為VP1 結(jié)構(gòu)蛋白，VP1 又包含兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是保守的S 結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)是更具可變性的P 結(jié)構(gòu)域；ORF3 編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2，它在BNoV 病毒顆粒中起著穩(wěn)定作用[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，該病毒的基因重組多發(fā)生在ORF1 和ORF2。

目前在新疆地區(qū)關(guān)于BNoV 的研究較少，僅2020 年報(bào)道在87 份新疆地區(qū)的犢牛腹瀉樣品中檢測(cè)出6 個(gè)陽性，陽性率為6.9%[4]，暫時(shí)未見新疆地區(qū)BNoV 的全基因組序列的研究。為了進(jìn)一步完善新疆地區(qū)BNoV 的基因型研究，本研究采用RT-PCR 方法對(duì)新疆部分地區(qū)開展了BNoV 感染的調(diào)查，并且對(duì)其ORF1 基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化和基因重組分析，填補(bǔ)了新疆地區(qū)對(duì)BNoV 基因序列研究的空白，為新疆地區(qū)BNoV 感染的防制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料TRIzol 購自Invitrogen，Hifair?III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（gDNA digester plus）、MolPure?Plasmid Mini Kit 購自翌圣生物科技（上海）有限公司；2×TaqPCR Mix、Universal DNA Purification Kit、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均購自天根生化科技（北京）有限公司；pGEM?-T Easy Vector System I 購自Promega公司。

1.2 樣品來源及處理230 份3 月齡犢牛糞便樣品為2020 年7 月至2021 年6 月分別采自新疆烏魯木齊、塔城、伊犁、喀什地區(qū)的牛場(chǎng)。將糞便樣品按1∶3 的比例用1×PBS溶液稀釋混勻后于-20 ℃反復(fù)凍融3次備用。

1.3 BNoV 流行病學(xué)調(diào)查參照GenBank 登錄的BNoV 序列的RdRp 基因序列（MN480761.1），利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物：5′-ATCTCGCACGATGCCAAG-3′/5′-GTCATCTTCATTTACAAAATCGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為342 bp，引物由上海生物工程有限公司合成。采用TRIzol 試劑/氯仿分層法提取1.2 中糞便樣品RNA，利用Hifair?III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（gDNA digester plus）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，采用上述引物，利用PCR 方法檢測(cè)糞便樣品中BNoV，對(duì)檢測(cè)結(jié)果根據(jù)區(qū)域因素分析新疆地區(qū)犢牛BNoV的感染情況。

1.4 BNoV ORF1 基因的PCR 擴(kuò)增參照GenBank中BNoV 序 列 的ORF1 基 因（MN480761.1），利 用Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物（表1），引物由上海生物工程有限公司合成。選取塔城地區(qū)兩份陽性樣品，按照1.3中方法獲得模板后，利用表1 中引物分段擴(kuò)增ORF1全基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生物工程有限公司測(cè)序后，對(duì)測(cè)序結(jié)果使用SeqMan 5.08 拼接獲得ORF1全基因序列。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 BNoV ORF1 基因序列分析參考NCBI 中20株NoV 各型ORF1 基因組序列，使用Clustal W 對(duì)獲得的ORF1 全基因序列比對(duì)，然后采用MEGA 7.0 軟件，neighbour-joining 法，Bootstrap method 1000 構(gòu) 建進(jìn)化樹；利用DNAStar 軟件中的MegAlign 對(duì)該ORF1基因序列與國內(nèi)外的ORF1 基因序列分別進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列的同源性分析；利用Simplot 分析該ORF1重組情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 BNoV 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果由于RdRp 基因是BNoV 遺傳與進(jìn)化的重要基因之一[5]，該基因較短，更易獲得，所以常常被作為檢測(cè)BNoV 時(shí)的靶基因。本研究以RdRp 基因保守區(qū)為目的片段，利用RT-PCR 技術(shù)對(duì)新疆4 個(gè)地區(qū)7 個(gè)牛場(chǎng)的230 份3 月齡犢牛糞便樣品進(jìn)行BNoV 流行情況檢測(cè)，結(jié)果顯示新疆地區(qū)230 份樣品中共檢測(cè)出41 份BNoV 陽性樣品，陽性率為17.83%（41/230），部分糞便樣品的PCR 檢測(cè)結(jié)果見圖1。其中烏魯木齊地區(qū)陽性率0.26%（1/38），塔城地區(qū)陽性率60.00%（9/15），伊犁地區(qū)陽性率3.51%（2/57），喀什地區(qū)陽性率24.16%（29/120）。結(jié)果表明BNoV 在新疆地區(qū)廣泛存在，且流行情況存在區(qū)域差異。犢牛BNoV 感染一方面與犢牛自身免疫力不足以及環(huán)境氣候惡劣有關(guān)，另一方面與養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理不當(dāng)也有一定關(guān)系[6]，包括犢牛初乳飼喂不及時(shí)、抗寒措施不到位、疫病隔離不合理等[7]。本研究采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)塔城以及喀什地區(qū)牛場(chǎng)多建立在沙漠地帶，存在自然環(huán)境差，水資源缺乏，水質(zhì)差（硫含量較高），犢牛舍環(huán)境不達(dá)標(biāo)，消殺程序不完善，新生犢牛初乳攝入量不足等問題，這些可能是造成這些區(qū)域BNoV 檢出陽性率偏高的原因。而烏魯木齊、伊犁均屬于北疆地區(qū)，北疆環(huán)境相對(duì)于南疆更加適合養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，且北疆地區(qū)獸醫(yī)及養(yǎng)殖人員專業(yè)化程度更高，因此這些地區(qū)BNoV 的檢出率低。

圖1 部分樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR detection results of some samples

BNoV 流行較廣，相繼在比利時(shí)[8]、英國[9]、美國俄亥俄州[10]、韓國[11]、土耳其[12]、法國[13]等全球多個(gè)國家檢出。在國內(nèi)多個(gè)地區(qū)也已檢出BNoV，且陽性率較高。師志海在2018年河南省8個(gè)腹瀉樣品中檢測(cè)出2 份陽性，陽性率為25%[14]。王玥琳在2017 年～2018年對(duì)國內(nèi)5 個(gè)省的BNoV 檢出率分別是四川34.78%（8/23）、遼寧75.00%（12/16）、河南11.11%（3/27）、山東9.09%（1/11）和陜西0（0/16）[15]。王文佳于2017 年到2019 年對(duì)河南省BNoV 的檢出率為9.96%（20/221）[16]。而新疆地區(qū)直到2020 年王玥琳在87 份犢牛腹瀉樣品中檢測(cè)出6 個(gè)陽性，陽性率為6.9%，證實(shí)了BNoV在新疆地區(qū)的存在[2]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)新疆地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也進(jìn)一步說明BNoV 具有廣泛的地區(qū)流行特征，且新疆多地犢牛感染了該病毒。

2.2 BNoV ORF1 基因的PCR 擴(kuò)增及序列分析結(jié)果選取塔城兩個(gè)BNoV 陽性樣品，分別分段擴(kuò)增BNoV ORF1 基因片段（圖2），經(jīng)拼接后ORF1 基因長度均為5 055 bp。分別命名為Bo/XJ-TC/2020/China（Gen-Bank： OK254099）和Bo/XJ- TC- 2/2021/China（Gen-Bank：OL304917）。

圖2 ORF1基因的分段擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of BNoV ORF1 gene amplification

分別與GenBank 中的20 株NoV ORF1 基因進(jìn)行核苷酸序列對(duì)比，并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，檢測(cè)到的Bo/XJ-TC/2020/China 和Bo/XJ-TC-2/2021/China BNoV 與中國四川地區(qū)OK32546.1 病毒株位于一個(gè)分支（圖3A）；進(jìn)一步與GenBank中14株BNoV GIII ORF1基因構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的Bo/XJTC/2020/China 和Bo/XJ-TC-2/2021/China 均屬于GIII.2型BNoV（圖3B）。

圖3 BNoV GIII型遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of NoV(A)and BNoV GIII type(B)

上述結(jié)果表明新疆塔城地區(qū)BNoV 與國內(nèi)不同地區(qū)的GIII.2 型BNoV 均為同一進(jìn)化簇，是源于同一株BNoV 進(jìn)化而來，并且與國內(nèi)BNoV 的相似性較高，與國外BNoV 的相似性較低。

對(duì)比國內(nèi)外幾株GIII.2 型BNoV ORF1 基因序列，結(jié)果顯示Bo/XJ-TC/2020/China 和Bo/XJ-TC-2/2021/China ORF1 基因序列的同源性為100%；與中國四川地區(qū)OK032546 病毒株相應(yīng)基因序列同源性最高，為99.6%；與中國江蘇地區(qū)MW810336 病毒株同源性最低，為82.8%，與國外其他幾株的核苷酸同源性為91.3%～96.4%。Bo/XJ-TC/2020/China 和Bo/XJ-TC-2/2021/China ORF1 編碼氨基酸序列之間的同源性為99.9%；與中國河北地區(qū)MZ573197 病毒株相應(yīng)氨基酸序列同源性最高，為98.3%；與中國江蘇地區(qū)MW810336 病毒株相應(yīng)氨基酸序列同源性最低，為76.1%；與國外其他幾株的相應(yīng)氨基酸序列同源性為96.6%～98.3%。表明塔城地區(qū)BNoV 和其他GIII.2 型BNoV 源于同一株BNoV 進(jìn)化而來，該BNoV的變異程度較低。

近年來韓國[17]，烏拉圭[18]等國相繼檢測(cè)到了BNoV GIII.2 型，師志海等人在2018 年檢測(cè)到BNoV GIII.2型[14]。本實(shí)驗(yàn)中的2株BNoV的ORF1基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果也顯示均為GIII.2 型，可見BNoV GIII.2 型目前已呈現(xiàn)全球廣泛流行。

2.3 BNoV ORF1 基因重組分析結(jié)果對(duì)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的BNoV ORF1 基因進(jìn)行基因重組分析，結(jié)果顯示其與挪威、英國和比利時(shí)報(bào)道的GIII.2 型病毒株ORF1 基因中未出現(xiàn)基因重組現(xiàn)象。表明本研究檢測(cè)到的BNoV 在ORF1 基因中無基因重組現(xiàn)象發(fā)生。王文佳等人在2020年報(bào)道了BNoV VP1（即為ORF2）基因和ORF1-ORF2 連接處預(yù)測(cè)到了基因重組現(xiàn)象[16]。在2020 年也報(bào)道了BNoV 基因重組現(xiàn)象的發(fā)生，且基因重組位點(diǎn)也發(fā)生在ORF1-ORF2 連接處[18]。說明BNoV基因變異的情況多發(fā)生在ORF1-ORF2 連接處，應(yīng)對(duì)BNoV 該區(qū)域基因序列重點(diǎn)關(guān)注，并預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)的抗原表位，為疫苗的研制提供更多理論依據(jù)。

本研究結(jié)果表明BNoV 在新疆地區(qū)的感染率較高，且在多個(gè)地區(qū)流行，并首次報(bào)告了新疆地區(qū)BNoV 與國內(nèi)外BNoV 在ORF1 基因無重組現(xiàn)象。