姚瓊 吳國飄 葉紅于 莊才翔 林一均 鄒詣 鄭炎焱

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性腫瘤。高級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長迅速、預(yù)后差，多數(shù)患者在確診后1～2年內(nèi)死亡[1]。在諸多腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的相關(guān)調(diào)控分子中，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是近年來受到人們關(guān)注的熱點(diǎn)[2]。對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行微陣列芯片測序分析發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中l(wèi)ncRNA LYPLAL1-AS1表達(dá)水平明顯低于瘤旁組織，但其生物學(xué)功能和作用機(jī)制仍不明確。本研究探討lncRNA LYPLAL1-AS1對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料及分組 正常星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。攜帶熒光標(biāo)記的LYPLAL1-AS1高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞（LYPLAL1-AS1-OE U87）及U251細(xì)胞（LYPLAL1-AS1-OE U251）、陰性對(duì)照U87細(xì)胞（OEC U87）和U251細(xì)胞（OEC U251）均購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司（批號(hào)：bio-105821、bio-73585、bio-53915、bio-72947）。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基和血清購自美國Gibco公司（批號(hào)：PM150110）。Trizol試劑購自美國ThermoFisher公司（批號(hào)：15596026）。Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司（批號(hào)：D6110A）。SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自凱杰生物工程（深圳）有限公司（批號(hào)：218073）。Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室購自美國Corning公司（批號(hào)：Matrigel 354234）。引物、LYPLAL1-AS1全長及突變序列購自廣州RiboBio公司（批號(hào)：SIGS0015358）。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）抗體購自美國Sigma-Aldrich公司（批號(hào)：MFCD00145904）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司的雄性裸鼠，24只，體重（25.68±1.36）g，分為4組：LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組。每組6只。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物房溫度（22±2）℃，濕度50%～70%，每日白天和黑夜各12 h，提供足夠的飼料和水。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫審（2020）第（271）號(hào)]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、消化和傳代 將正常星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251分別設(shè)為正常星形膠質(zhì)細(xì)胞組、U87組和U251組，在37℃、5%CO2的條件下，使用含10%FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度70%左右，使用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。另將LYPLAL1-AS1-OE U87、OEC U87、LYPLAL1-AS1-OE U251、OEC U251細(xì)胞設(shè)為 LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、消化和傳代，留作備用。

1.4 LYPLAL1-AS1表達(dá)水平的檢測 根據(jù)說明書步驟，利用TRIzol試劑從3組細(xì)胞中分離總RNA。使用Takara的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR），檢測LYPLAL1-AS1表達(dá)水平。LYPLAL1-AS1引物序列為：5'-CTCACCAGCTGTGGCCTTTTA-3'和5'-CTGCTCCCCCTTTG CATGT-3'；內(nèi)參基因β-actin引物序列為：5'-ACCGAGCGCGGCTACAG-3'和5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'。LYPLAL1-AS1的相對(duì)表達(dá)水平=LYPLAL1-AS1基因的表達(dá)水平/內(nèi)參基因的表達(dá)水平。采用上述同樣方法檢測LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組4組細(xì)胞中LYPLAL1-AS1表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)量的檢測 采用Transwell小室法。細(xì)胞培養(yǎng)消化后重懸，計(jì)數(shù)水平為2×105個(gè)/ml。將Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按照1∶8比例混合均勻，加入Transwell小室，在底部凝固后形成Matrigel凝膠層。小室下孔加入15%FBS RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，小室中加入200 μl無血清的細(xì)胞懸液，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，48 h后采用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，每孔計(jì)算5個(gè)視野中的侵襲細(xì)胞數(shù)。然后行遷移實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)基本相同。觀測LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)量。

1.6 4組裸鼠顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度檢測 將LYPLAL1-AS1-OE U87、OEC U87、LYPLAL1-AS1-OE U251和OEC U251這4組細(xì)胞，以PBS清洗重懸為2×107個(gè)/ml，接種于4組裸鼠。裸鼠麻醉后，將細(xì)胞注射至相應(yīng)組別裸鼠顱內(nèi)頂枕區(qū)，分別于第14天和第28天采用美國Perkin Elmer動(dòng)物活體成像系統(tǒng)拍攝裸鼠顱內(nèi)腫瘤生長情況、檢測相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.7 兩組裸鼠顱內(nèi)腫瘤組織免疫組化的檢測 第40天取LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組各2只裸鼠，過量吸入乙醚處死，取腦組織于4%多聚甲酫固定、脫水、包埋并切片，采用GFAP抗體對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色，顯微鏡下放大100倍和400倍成像，觀察腫瘤細(xì)胞聚集、組織壞死或血管浸潤等情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常星形膠質(zhì)細(xì)胞組、U87組和U251組細(xì)胞LYPLAL1-AS1表達(dá)水平比較 qRT-PCR結(jié)果顯示，U87組和U251組LYPLAL1-AS1表達(dá)水平均低于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖1。

圖1 正常星形膠質(zhì)細(xì)胞組、U87組和U251組中LYPLAL1-AS1表達(dá)水平的比較

2.2 LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組LYPLAL1-AS1表達(dá)水平比較 qRT-PCR結(jié)果顯示，LYPLAL1-AS1-OE U87組和LYPLAL1-AS1-OE U251組LYPLAL1-AS1表達(dá)水平均高于OEC U87組和OEC U251組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖2。

圖2 LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組LYPLAL1-AS1表達(dá)水平比較

2.3 LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)量的檢測 LYPLAL1-AS1-OE U87組和LYPLAL1-AS1-OE U251組侵襲細(xì)胞數(shù)量均少于OEC U87組和OEC U251組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。LYPLAL1-AS1-OE U87組和 LYPLAL1-AS1-OE U251組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量亦少于OEC U87組和OEC U251組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。

表1 4組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)量的比較

2.4 4組裸鼠顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度的檢測 第14天LYPLAL1-AS1-OE U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組裸鼠顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度與OEC U87組、OEC U251組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。第28天LYPLAL1-AS1-OE U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組裸鼠顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度均低于OEC U87組、OEC U251組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖3。

圖3 4組裸鼠顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度的檢測

2.5 兩組裸鼠顱內(nèi)腫瘤組織免疫組化的檢測 免疫組化染色顯示，OEC U87組腦組織腫瘤細(xì)胞呈長梭形或星形，組織內(nèi)多出現(xiàn)壞死，腫瘤細(xì)胞常聚集，生長呈束裝或小團(tuán)塊狀，且圍繞小血管呈局灶性浸潤生長，生長活躍。LYPLAL1-AS1-OE U87組腫瘤細(xì)胞呈長梭形或圓形，雖能見到細(xì)胞聚集，但多數(shù)細(xì)胞分布均勻，組織壞死程度和浸潤性較低，見圖4。

圖4 OEC U87組和LYPLAL1-AS1-OE U87組顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞的免疫組化染色圖（a：OEC U87組，×100；b：LYPLAL1-AS1-OE U87組，×100；c：OEC U87組，×400；d：LYPLAL1-AS1-OE U87組，×400；箭頭所示為腫瘤細(xì)胞聚集、組織壞死或血管浸潤等現(xiàn)象）

3 討論

近年來關(guān)于lncRNA的研究進(jìn)展迅猛，雖然已證實(shí)lncRNA如Linc00475、lncRNA-THOR、lncRNA-EGFRAS1等的表達(dá)異常與神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展高度相關(guān)[3-5]，但絕大部分lncRNA功能仍有待研究。新近對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的微陣列測序數(shù)據(jù)表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織LYPLAL1-AS1表達(dá)水平明顯低于癌旁組織,而胰腺導(dǎo)管腺癌組織研究也發(fā)現(xiàn)，胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的LYPLAL1-AS1表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，提示LYPLAL1-AS1可能是重要的抑癌基因[6]。

本研究分析神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LYPLAL1-AS1表達(dá)水平和生物學(xué)功能。結(jié)果證實(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LYPLAL1-AS1呈低表達(dá)，可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移，裸鼠原位接種實(shí)驗(yàn)也證實(shí)LYPLAL1-AS1可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長。

雖然明確了LYPLAL1-AS1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)功能，但其機(jī)制尚不清楚。在lncRNA調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展中，由lncRNA、miRNA、mRNA以及假基因等構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)即“競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）”是最為經(jīng)典的致癌或抑癌調(diào)控機(jī)制之一[2]。ceRNA精確轉(zhuǎn)錄調(diào)控目的基因的表達(dá)依賴于lncRNA-miRNAs-mRNA三者之間的互作實(shí)現(xiàn)[7]。miRNA可通過互補(bǔ)序列結(jié)合在mRNA的3'-UTR，進(jìn)而負(fù)向調(diào)控下游基因。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測方法，篩選到Lnc-LYPLAL1-AS1的一個(gè)潛在結(jié)合靶點(diǎn)miRNA217（miR-217）。有研究表明，miR-217的表達(dá)水平在多種腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中均顯著上調(diào)，且具有致瘤作用。miR-217是參與包括淋巴瘤、骨肉瘤、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等腫瘤發(fā)生、發(fā)展的致癌分子[8]。體外實(shí)驗(yàn)揭示，miR-217上調(diào)表達(dá)將顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲、遷移和增殖能力[9-10]。本研究的結(jié)果也證實(shí)，miR-217在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá)。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)推測LYPLAL1-AS1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)水平將抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移現(xiàn)象，而這一調(diào)控作用可能是和miR-217有關(guān)。

酪氨酸3/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白γ（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein gamma polypeptide,YWHAG）則是miR-217下游調(diào)控靶點(diǎn)之一，其具有抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存、增殖、遷移、侵襲和有絲分裂的功能，上調(diào)細(xì)胞miR-217水平可靶向降低YWHAG水平從而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲和遷移的進(jìn)展[8，11]。YWHAG通過與含有磷酸絲氨酸的蛋白質(zhì)結(jié)合而介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在包括細(xì)胞存活和凋亡，蛋白質(zhì)運(yùn)輸，以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。已有研究表明，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，高表達(dá)YWHAG可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞生長[11-12]。已有研究闡明，在U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-217靶向結(jié)合YWHAG mRNA，可抑制YWHAG的表達(dá)，同時(shí)逆轉(zhuǎn)YWHAG對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用，促進(jìn)U87細(xì)胞遷移、侵襲和增殖?；谝炎C實(shí)的miR-217與YWHAG的靶向結(jié)合特性，本實(shí)驗(yàn)下一步計(jì)劃首先利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LYPLAL1-AS1與miR-217是否結(jié)合，以及探索LYPLAL1-AS1/miR-217/YWHAG三者之間的關(guān)系。

綜上所述，Lnc-LYPLAL1-AS1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要的抑癌作用，其作用機(jī)制可能是通過靶向調(diào)控miR-217/YWHAG表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑癌的功能。靶向調(diào)控Lnc-LYPLAL1-AS1的表達(dá)可能為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的防治提供新的策略。