胡亞冬，雷明科，侯勝春，鄧少雅，范德朋

（碧沃豐生物科技（廣東）股份有限公司，廣東 佛山 528200）

石油被稱為工業(yè)的血液，主要成分是烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴[1]。在勘探、開(kāi)采、煉制、清罐和儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中，由于事故、跑冒滴漏、自然沉降等原因，大量石油與土壤或其他雜質(zhì)形成混合物，這就是石油污泥，簡(jiǎn)稱油泥[2]。油泥成分復(fù)雜，含有大量老化原油、瀝青質(zhì)、膠質(zhì)、石蠟、懸浮固體以及各種酸性與腐燭性藥劑，具有難降解、有毒、有害等特點(diǎn)，直接堆放在自然環(huán)境中，會(huì)造成土壤、植被和水體等生態(tài)系統(tǒng)的污染[3]。近年來(lái)，眾多含油污泥處理方法在國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用，物理法有填埋、分散施耕和調(diào)質(zhì)離心分離等，化學(xué)法有焚燒、固化處理、氧化降解和熱解等，它們本身存在不足，成本高，易造成二次污染。生物法特別是微生物修復(fù)技術(shù)，因其成本低，節(jié)能環(huán)保，降解徹底，目前被公認(rèn)是最具潛力的石油污染治理方法。本研究從石油污泥中富集、篩選得到高效除油微生物，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，并初步研究了其對(duì)含油污泥的除油效果，為石油污染土壤的治理和修復(fù)提供更多微生物資源和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)過(guò)程

1.1 試驗(yàn)材料

石油污泥來(lái)自東營(yíng)油田石油污染土壤，其石油類含量為3.52×104mg/kg，菌落數(shù)為1.20×107CFU/g。化學(xué)試劑采購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，均為分析純。生物學(xué)試劑采購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。潤(rùn)滑油為摩潤(rùn)克潤(rùn)滑油有限公司46 號(hào)潤(rùn)滑油，密度為0.8 g/mL。此外，試驗(yàn)材料還有五類。

1.1.1 微量元素溶液

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）濃度為28 g/L，七水硫酸亞鐵濃度為2 g/L，七水硫酸鋅濃度為1.56 g/L，無(wú)水氯化鈣濃度為2.2 g/L，七水硫酸鎂濃度為4 g/L，一水硫酸錳濃度為1.76 g/L，四水合鉬酸銨濃度為0.44 g/L，五水硫酸銅濃度為0.64 g/L，六水氯化鈷濃度為0.64 g/L。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

硫酸銨濃度為1 g/L，硝酸鉀濃度為1.5 g/L，酵母浸粉濃度為1 g/L，七水硫酸鎂濃度為0.4 g/L，1 mol/L 磷酸緩沖液添加量為10 mL/L，微量元素溶液添加量為5 mL/L，pH 保持在7.0～7.2。

1.1.3 測(cè)試培養(yǎng)基

潤(rùn)滑油濃度為8 g/L，硫酸銨濃度為0.4 g/L，硝酸鉀濃度為0.6 g/L，酵母浸粉濃度為0.1 g/L，七水硫酸鎂濃度為0.04 g/L，1 mol/L 磷酸緩沖液添加量為1.5 mL/L，微量元素溶液添加量為0.5 mL/L，pH 保持在7.0～7.2。

1.1.4 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

蛋白胨濃度為10 g/L，牛肉浸粉濃度為3 g/L，氯化鈉濃度為5 g/L，pH 保持在7.0～7.2。營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂粉。

1.1.5 篩選平板

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2 g/L 瓊脂，倒好平板備用。另取5 mL 潤(rùn)滑油溶于45 mL 石油醚中，用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。每個(gè)平板取1 mL 已過(guò)濾除菌的潤(rùn)滑油溶液涂布于凝固平板上，待石油醚揮發(fā)后即可使用。

1.2 儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備有DLHR-802 恒溫振蕩器、GI54DWS 立式壓力蒸汽滅菌器、T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和OIL 480 紅外線測(cè)油儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 除油菌的富集與篩選

取石油污泥約10 g，將其加入到100 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃溫度下振蕩培養(yǎng)2 周左右，獲得富集培養(yǎng)液。富集培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋到不同濃度并涂布于篩選平板，30 ℃溫度下培養(yǎng)5～7 d。從篩選平板上挑取菌落191 個(gè)，接種于測(cè)試培養(yǎng)基中，溫度30 ℃和轉(zhuǎn)速150 r/min 條件下培養(yǎng)2 周。培養(yǎng)結(jié)束后，采用紫外分光光度法測(cè)定潤(rùn)滑油含量，并計(jì)算2 周內(nèi)潤(rùn)滑油降解速率。

1.3.2 除油菌的分子生物學(xué)鑒定

挑選潤(rùn)滑油降解速率較高的兩種菌落B016 和B069，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)16SrDNA 序列鑒定，測(cè)序由廣州艾基生物技術(shù)有限公司完成，序列通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）Blast 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，初步鑒定種屬。

1.3.3 菌株對(duì)石油污泥除油效果的研究

將B016 和B069 分別接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，溫度30 ℃和轉(zhuǎn)速150 r/min 條件下培養(yǎng)過(guò)夜；準(zhǔn)備12個(gè)錐形瓶（容積500 mL），每瓶加入10 g 石油污泥，并補(bǔ)充100 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，振蕩混勻。分組時(shí)，石油污泥混合物中，B016 組加入B016 培養(yǎng)過(guò)夜的菌液1 mL，B069 組加入B069 培養(yǎng)過(guò)夜的菌液1 mL，（B016+B069）混合組加入B016、B069 培養(yǎng)過(guò)夜的菌液各0.5 mL?？瞻捉M不加入菌液作為對(duì)照。溫度30 ℃和轉(zhuǎn)速150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)7 d。每組設(shè)置3 個(gè)平行。培養(yǎng)7 d 后，殘留的石油類濃度依據(jù)《水質(zhì) 石油類和動(dòng)植物油類的測(cè)定 紅外分光光度法》（HJ 637—2018）進(jìn)行檢測(cè)[4]。

1.4 分析方法

潤(rùn)滑油含量檢測(cè)采用紫外分光光度法[5]，利用潤(rùn)滑油在波長(zhǎng)260 nm 處有特征吸收峰的特點(diǎn)測(cè)定潤(rùn)滑油含量，計(jì)算潤(rùn)滑油降解速率，單位為mg/（L·d）。石油類含量檢測(cè)采用紅外分光光度法[4]。

2 結(jié)果與討論

2.1 除油菌的篩選及形態(tài)觀察

經(jīng)初篩和復(fù)篩，獲得2 株有較好除油性能的菌株B016 和B069。在潤(rùn)滑油底物濃度為8 g/L 的條件下，B016 和B069 的潤(rùn)滑油降解速率分別達(dá)到199.0 mg/（L·d）和109.5 mg/（L·d）。形態(tài)觀察如圖1、圖2所示，B016 和B069 均為革蘭氏陰性桿菌，但兩者菌落特征不一致。B016 菌落表面粗糙不透明，呈黃色，邊緣呈裂葉狀，有環(huán)形褶起；B069 菌落表面光滑不透明，呈乳白色和凸圓狀。

圖1 B016 的革蘭氏染色鏡檢圖（放大1 000 倍）

圖2 B069 的革蘭氏染色鏡檢圖（放大1 000 倍）

2.2 除油菌的分子生物學(xué)鑒定

B016 和B069 的純種培養(yǎng)液經(jīng)16srDNA 測(cè)序，序列經(jīng)NCBI Blast 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，B016 與裂解亞氯酸假單胞菌（Pseudomonas chloritidismutan）的相似度最高，匹配度達(dá)99.93%；B069 與嗜根寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）的相似度最高，匹配度達(dá)99.64%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，菌株B016 為假單胞菌屬，菌株B069 為寡養(yǎng)單胞菌屬。

2.3 菌株對(duì)石油污泥除油效果的研究

為考察B016 和B069 對(duì)石油污泥的實(shí)際除油效果，以1#石油污泥為底物（底物中石油類濃度3 520 mg/L），進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在搖瓶培養(yǎng)條件下，空白組、B016 組、B069 組和混合組的石油類去除率分別為17%、86%、70%和92%，如圖3所示?？瞻捉M因石油污泥中也含有原生土著菌，在該試驗(yàn)條件下，7 d 土著微生物除油率平均為17%，而加入除油微生物B016、B069 進(jìn)行生物強(qiáng)化后，除油效果大大增加，特別是混合組除油率要大于單菌組，說(shuō)明微生物除油可能存在一定的協(xié)同促進(jìn)作用。而這種協(xié)同機(jī)制在復(fù)雜有機(jī)物（烴類、芳香族）的微生物降解中也是普遍存在的[6]。

圖3 菌株實(shí)際除油效果

3 結(jié)論

本研究在石油污泥中篩選出兩株較高除油效率的菌株，經(jīng)16srDNA 分子生物學(xué)鑒定，菌株B016 為假單胞菌屬，菌株B069 為寡養(yǎng)單胞菌屬。潤(rùn)滑油底物濃度為8 g/L 時(shí)，測(cè)定除油菌對(duì)潤(rùn)滑油的降解速率，B016為199.0 mg/（L·d），B069 為109.5 mg/（L·d）。B016 和B069 以實(shí)際石油污泥為底物進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，7 d內(nèi)石油類去除率分別達(dá)到86%、70%。兩者混合投加，具有一定的協(xié)同促進(jìn)作用，去除率可達(dá)到92%。