張秀偉，鮑 菊，張萬萍，蔡甫格，牛力立

（1．安順市農(nóng)業(yè)科學院，貴州 安順 561000；2．貴州大學農(nóng)學院，貴州 貴陽 550025）

花臉香蘑[Lepista sordida（Fr．）Singer]隸屬傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomatacete）香蘑屬（Lepista），其香味濃郁、口感清脆、色澤怡人，蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸種類齊全，還富含多種微量元素和維生素，營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值極高，是一種開發(fā)價值很高的食用菌[1-2]。從上世紀90年代開始，就有關(guān)于花臉香蘑人工馴化栽培及小規(guī)模試驗的相關(guān)報道，但因存在著產(chǎn)量不高，品質(zhì)不佳和穩(wěn)定性差等問題，至今未實現(xiàn)大規(guī)模栽培[3]。貴州黔中地區(qū)氣候溫暖濕潤，冬暖夏涼，菌物資源豐富；花臉香蘑在該地區(qū)各處都有零星分布，當?shù)厝朔Q之為“米湯菌”或“毛草菌”，野外出菇時間一般為4月～6月或9月～10月。通過對黔中地區(qū)不同來源地的花臉香蘑資源進行分離鑒定，并根據(jù)當?shù)貧夂蛱攸c進行秋栽冬收試驗，擬篩選出優(yōu)良菌株及配套栽培模式，以促進花臉香蘑的開發(fā)利用。

目前，花臉香蘑栽培相關(guān)研究中，一般選用稻草、麥稈、竹糠、木屑、棉籽殼等為原料進行栽培[4]。貴州省是茶樹種植大省，每年茶樹枝葉修剪量約為300 kg·667-1m-2～500 kg·667-1m-2[5]，試驗以修剪下的茶樹枝葉為主要栽培料，研究花臉香蘑培養(yǎng)料的新配方。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株NK、LM、GS、JUF分別采自貴州省的普定縣、鎮(zhèn)寧縣、長順縣廣順鎮(zhèn)及安順市。組織分離純化后的4個菌株均保存于安順市農(nóng)科院分子生物實驗室內(nèi)。

1.2 菌種分離

以新鮮、無蟲害的野生子實體為試驗樣品，采用組織分離法獲得菌種。先使用75%酒精棉球?qū)ψ訉嶓w表面進行消毒，后將子實體從菌蓋中間掰開，從菌蓋、菌柄交接處取一小塊菌肉接入PDA平板上，接種完成后將培養(yǎng)皿放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，期間記錄菌落形態(tài)、顏色、菌絲密度及菌絲長滿培養(yǎng)皿的時間。

1.3 品種鑒定

1．3．1 形態(tài)鑒定

以子實體的顏色、形狀、菌蓋直徑、菌柄長度和直徑、菌褶等形態(tài)特征為依據(jù)，對照相關(guān)分類學工具書，對野生子實體進行初步形態(tài)鑒定[6]。

1．3．2 分子生物學鑒定

利用磁珠法、基因組DNA提取試劑盒提取4個菌株菌絲體的 DNA，以ITS5（5′-GGAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物進行擴增。PCR反應體系（30 μL）為：2× Taq PCR Master mix（GeneTech）15 μL，引物 ITS5和ITS4各1 μL，DNA 1 μL，超純水補足至30 μL。PCR反應程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物由武漢天一華煜基因科技有限公司進行測序，序列在GenBank上進行BLAST比對。

1．3．3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

應用 MEGA 7．0 軟件以香菇（Lentinula edodes）為外群，對4個樣品序列及以GenBank下載的19個香蘑屬樣品的ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用最大似然法（maximum likelihood method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以Bootstrap法，經(jīng)1 000次循環(huán)檢驗系統(tǒng)樹的可靠性。

1.4 秋栽馴化

1．4．1 栽培時間及場地

栽培時間為2021年9月18日；場地位于安順市農(nóng)業(yè)科學院食用菌栽培大棚（綠白膜）。

1．4．2 原種培養(yǎng)料配方及制作

原種培養(yǎng)料配方：高粱94%、麥麩5%、石灰1%。

將稱取好的高粱用清水沖洗3次，在含有1%的石灰水中浸泡24 h，濾除多余水分后加入麥麩攪拌均勻，裝入12 cm×24 cm×0．005 cm的聚丙烯塑料袋中，121℃高壓滅菌3 h。將培養(yǎng)好的母種轉(zhuǎn)接在原種袋內(nèi)，于25℃條件下培養(yǎng)至菌絲滿袋后備用。

1．4．3 栽培種培養(yǎng)料配方及制作

栽培種培養(yǎng)料配方：茶樹枝葉碎屑80%、玉米面17%、石灰2%、石膏1%。

將修剪下的茶樹枝葉經(jīng)粉碎機粉碎后，按配方稱取各種原料。先將茶樹枝葉碎屑和玉米面攪拌均勻，石灰、石膏溶于水后再與培養(yǎng)料混勻，使培養(yǎng)料最終含水量達65%～70%。備好的培養(yǎng)料建堆（高度為 1．2 m～1．5 m、寬度為 2．0 m～2．5 m），按照孔距為30 cm、行距為50 cm的標準，在料堆上打通氣孔。當料溫達70℃并保持1天后及時翻堆，經(jīng)過3次翻堆后，發(fā)酵料蓬松疏軟，長滿白色放線菌，無臭味，pH 為 7．5。

1．4．4 栽培場地及覆土材料處理

栽培前先對床面進行預濕，用農(nóng)藥“敵菇蟲”處理大棚，并在床面撒石灰以消毒。覆土時選用土質(zhì)肥沃、結(jié)構(gòu)疏松且通氣性好的土壤[7]。使用前用0．5%甲醛噴灑土壤，拌勻后堆置，用薄膜密封5 d；去掉薄膜，將土壤攤晾，待藥味揮發(fā)后再混入1%的石灰。

1．4．5 發(fā)酵料栽培

采用三層播種法，按照箱面寬1 m、料高15 cm的標準鋪料，每個菌株菌種用量為1．5 kg·25-1kg-1（干料）。播種后覆蓋薄膜進行發(fā)菌，待菌絲生長至培養(yǎng)料的2/3后進行覆土（厚度為3 cm），覆土結(jié)束則進入出菇管理期。記錄播種、覆土、菌絲出土及原基形成的時間，觀測子實體的形態(tài)特征，統(tǒng)計產(chǎn)量并計算生物學效率。

生物學效率為子實體鮮質(zhì)量與栽培料干質(zhì)量的百分比值[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個野生菌株的形態(tài)鑒定

不同來源的樣品間菌蓋顏色存在一定差異，菌株NK呈深紫色，菌株LM呈淡紫色，菌株GS、JUF呈紫色。各菌株子實體形態(tài)特征詳見圖1。

如圖1所示，菌株NK、LM、GS、JUF的菌蓋直徑分別為2.0 cm～5.5 cm、4.0 cm～6.0 cm、2.0 cm～3.5 cm、2.0 cm～5.0 cm，均表現(xiàn)為近圓形，中間具臍，表面光滑，濕潤時半透明或水浸狀；菌褶較稀，延生，不等長；菌柄與菌蓋同色，實心；菌肉具有芳香氣味。結(jié)合《中國大型真菌彩色圖譜》初步將4株真菌鑒定為香蘑屬[9]。

2.2 4個野生菌株的培養(yǎng)特性

4個樣品經(jīng)菌種分離后，菌絲在PDA培養(yǎng)基上的生長情況詳見圖2。

如圖2所示，4個菌株平貼在平板培養(yǎng)基上生長，氣生菌絲不強，其中菌株NK和GS的菌落顏色較菌株LM和JUF深；菌株GS、NK菌絲長滿培養(yǎng)皿的時間分別為14 d、16 d，菌株LM和JUF菌絲長滿培養(yǎng)皿的時間相同，均為17 d。菌株GS生長速度最快，菌絲濃密，生長旺盛，爬壁能力較強；菌株NK、LM、JUF菌絲較濃密，但爬壁能力較弱。

2.3 4個野生菌株的分子鑒定

菌株GS、NK、LM、JUF的ITS序列全長分別為 651 bp、647 bp、650 bp、653 bp。在 GenBank進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，4個菌株與花臉香蘑Lepista sordida的相似性均高達99%，因此都鑒定為花臉香蘑。將菌株GS、NK、LM、JUF的ITS序列提交到GenBank，獲得4個菌株的登錄號分別為OK161036、OK161035、OK161034、OK161033。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以香菇Lentinula edodes為外群，基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

如圖3的系統(tǒng)發(fā)育樹所示，菌株GS、NK、LM、JUF與8個Lepista sordida聚為一支，且不同來源的樣品之間親緣關(guān)系較近，基因差異性不大，據(jù)此將4株真菌鑒定為花臉香蘑Lepista sordida。

2.5 馴化栽培

2．5．1 花臉香蘑在培養(yǎng)料上的生長情況

采用茶樹木屑對菌株NK、LM、GS、JUF進行秋季馴化試驗，于2021年9月18日進行播種，4個菌株在栽培種培養(yǎng)料上的生長情況詳見表1。

表1 4個花臉香蘑菌株在栽培種培養(yǎng)料上的生長情況Tab．1 Growth of four Lepista sordida strains on substrate of spawn

如表1所示，在溫度為20℃～25℃的條件下，菌株NK、GS僅需24 h即可萌發(fā)，3天后菌絲開始定植。4個菌株均能在菌絲開始定植后22 d完成發(fā)菌。表明茶樹修剪枝葉內(nèi)含有適合花臉香蘑生長所需的營養(yǎng)成分，是一種良好的栽培料。但不同菌株從播種至原基形成的時間存在一定的差異，菌株GS播種后30 d開始形成原基，菌株NK、LM分別需要27 d、40 d形成原基，菌株JUF未形成原基。

除了菌株JUF未出菇外，菌株NK、LM、GS均能出菇，各菌株子實體形態(tài)特征詳見表2和圖4。

表2 花臉香蘑菌株NK、LM和GS的子實體形態(tài)特征Tab．2 Morphological characteristics of fruit bodies of Lepista sordida strain NK,LM and GS

圖4 3個花臉香蘑菌株的出菇情況Fig．4 The fruiting status of three Lepista sordida strains

如表2所示，不同菌株的出菇特性差異較大，菌株NK原基粗壯，呈分散分布，單個子實體較大，單朵質(zhì)量達4 g～16 g，兩潮菇的生物學效率達25．6%；菌株GS原基呈集中分布，密度較大，子實體個體較小，單朵質(zhì)量為2 g～8 g，兩潮菇的生物學效率為24．5%；菌株LM出菇量較少，生物學效率僅為10．3%。

2．5．2 秋栽花臉香蘑的出菇采收情況

各花臉香蘑菌株于9月中旬進行發(fā)酵料栽培，10月中下旬進入出菇期。菌株GS的第1潮菇于11月5日全部采收；11月9日再次出現(xiàn)大量原基，11月25日第2潮菇采收結(jié)束；采收期為29 d。菌株NK的第1潮菇于11月11日全部采收；11月16日第2潮菇開始生長，至12月3日采收結(jié)束；采收期為33 d。菌株LM于11月6日開始采收，至12月3日結(jié)束，潮次不明顯；采收期為27 d。

花臉香蘑出菇期間日平均最高氣溫為14.85℃，最低平均溫度為10.38℃。過低的溫度將影響花臉香蘑的正常出菇，其影響情況詳見圖5。

圖5 菌株GS在低溫下的出菇情況Fig.5 The fruiting situation of strain GS at low temperature

如圖5所示，12月份拱棚內(nèi)最高平均氣溫約為10℃，此時花臉香蘑菇蕾的生長受到明顯抑制，呈僵化狀態(tài)，不能繼續(xù)生長形成子實體。

3 結(jié)論與討論

野生種質(zhì)資源是科研工作得以順利開展的重要基礎(chǔ)，對收集的野生資源進行形態(tài)和遺傳學鑒定是對其進行保護性開發(fā)的重要前提和保障[10]。ITS序列分析作為形態(tài)學分類的有益補充，已成為國際上廣泛使用的分子生物學鑒定方法[11]。將菌株GS、NK、LM、JUF的ITS序列在GenBank中進行 BLAST比對，結(jié)果顯示4個菌株與花臉香蘑Lepista sordida的相似度高達99%，結(jié)合形態(tài)學特征，可確定4株菌株均為花臉香蘑。從系統(tǒng)發(fā)育樹可知，在一定區(qū)域內(nèi)的花臉香蘑親緣關(guān)系較近，但形態(tài)特征上存在一定差異，可結(jié)合不同資源的特性開展雜交育種，以期獲得優(yōu)良菌株。

結(jié)合黔中地區(qū)冬暖夏涼的氣候優(yōu)勢對花臉香蘑進行秋栽冬收的研究，結(jié)果表明GS、NK、LM 3個菌株均能較好地出菇。因受低溫影響，子實體生長速度慢，但個體發(fā)育健壯，且病蟲害發(fā)生幾率低，能達到較高的產(chǎn)量，是一種值得推廣的栽培模式。菌株GS、NK、LM株的采收期分別為29 d、33 d、27 d，當小拱棚溫度降至10℃時，花臉香蘑不能正常生長。為延長花臉香蘑采收期，可進一步開展提前播種或秋冬季同時利用白色塑料大棚和遮陰網(wǎng)進行栽培的研究。

貴州省是茶樹種植大省，對于衰老的茶樹，常采取重修剪和臺割的方式讓其復壯，因此產(chǎn)生的茶樹枝葉量就會成倍增加；當前對茶樹枝葉的處理途徑主要為焚燒和還田2種方式，利用率極低[5]。近年來，食用菌栽培中木材消耗對當?shù)厣鷳B(tài)的影響已逐漸凸顯[12]，而利用茶樹枝葉作為主料栽培花臉香蘑可有效解決木材消耗的問題。研究表明茶樹枝葉碎屑在7天內(nèi)經(jīng)3次翻堆后即可完成發(fā)酵，最高溫度達70℃?；樝隳⒕N在茶樹枝葉發(fā)酵料上萌發(fā)時間短，發(fā)菌快，表明茶樹枝葉內(nèi)含有適合花臉香蘑生長所需的營養(yǎng)成分，是一種良好的栽培料，生物學效率達25%以上，研究結(jié)果開辟了花臉香蘑培養(yǎng)料的新途徑。