王紅,季莉莉,劉輝,李宏峰（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,天津 300120）

亞胺培南是臨床常用的對鮑曼不動(dòng)桿菌具有抗菌活性的和高度化學(xué)穩(wěn)定性的硫霉素類抗生素，但近年來亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株呈漸升趨勢，成為了臨床治療的挑戰(zhàn)[1]。本研究通過檢測分析亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥基因，以期為臨床合理的抗感染治療和控制醫(yī)院內(nèi)感染提供一些依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選取2021年5月-2022年5月從我院患者中分離出來的已剔除從同一患者中分離出來重復(fù)株的25株亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌作為試驗(yàn)對象，標(biāo)本來源為痰、咽拭子、分泌物、尿、血液和胸腹水等。

1.2儀器與試劑 亞胺培南、美羅培南、哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、阿米卡星、復(fù)方新諾明等藥物購于賽默飛世爾科技中國有限公司；細(xì)菌鑒定及藥敏卡片和VITEK-2全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)購自法國梅里埃公司；細(xì)菌恒溫恒濕培養(yǎng)箱購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；低速離心機(jī)購自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）基因擴(kuò)增儀購自賽默飛世爾科技有限公司；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；PCR試劑盒購自日本TAKARA BIO株式會(huì)社；PCR引物委托上海英濰捷基公司合成。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用法國梅里埃GN67和XN04藥敏卡對分離菌株進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2021年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）制定的藥敏判斷折點(diǎn)，耐藥菌株判斷標(biāo)準(zhǔn)為顯示亞胺培南最低抑菌濃度（MIC）≥16ug/mL。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.3.2耐藥基因檢測 細(xì)菌DNA提取方法為煮沸法，耐藥基因檢測方法為PCR法。耐藥基因引物序列參照參考文獻(xiàn)[2-3]設(shè)計(jì)，見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20uL，反應(yīng)條件為：預(yù)變性條件為94℃、5min，變性條件為94℃、1min，復(fù)性條件為55℃、35s，延伸條件為72℃、10min。PCR引物在進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后的特異性擴(kuò)增條帶觀察用凝膠成像儀，最終基因測序結(jié)果比對在Genbank上進(jìn)行相對應(yīng)序列比對。

表1 耐藥基因引物設(shè)計(jì)序列

2 結(jié)果

2.1抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 25株亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，對亞胺培南、美羅培南、哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢唑林、頭孢曲松、左氧氟沙星和阿米卡星等藥物均耐藥，有20株（80.00%，20/25）對復(fù)方新諾明敏感，見表2。

表2 25株亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.2碳青霉烯酶耐藥基因檢測結(jié)果 25株（100.00%，25/25）亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌均檢測出的碳青霉烯酶耐藥基因?yàn)镺XA-23和OXA-51，IMP-1、VIM-2、KPC、NDM-1、OXA-24、OXA-50和OXA-58基因均未檢出。

2.3氨基糖苷類及耐消毒劑相關(guān)基因檢測結(jié)果 24株（96.00%，24/25）亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌均檢測出氨基糖苷類耐藥基因ant(3'') -Ⅰ、aac(6') -Ⅰ和armA，有17株（68.00%，17/25）檢測出耐消毒劑相關(guān)基因qacE△1。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種易于生存、對營養(yǎng)要求不高和易在體內(nèi)定植的革蘭陰性短桿菌，是引發(fā)呼吸道感染、血源性感染和院內(nèi)感染的重要機(jī)會(huì)致病菌，但其耐藥率的增加成為了患者尤其是重癥患者的棘手治療問題[4-5]。本研究收集的25株亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌除對復(fù)方新諾明較敏感外，對其他抗菌藥物均耐藥，表明鮑曼不動(dòng)桿菌對碳青霉烯酶類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等抗生素均具較高耐藥率，而復(fù)方新諾明因其肝腎毒副作用較大而應(yīng)用受限，故探討亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制對研發(fā)新的藥物和控制感染具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，25株（100.00%，25/25）亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，碳青霉烯酶耐藥基因OXA-23和OXA-51的檢出率為100%，氨基糖苷類耐藥基因ant(3'')-Ⅰ,aac (6')-Ⅰ和armA的檢出率為96.00%，耐消毒劑相關(guān)基因qacE△1為68.00%，與既往孫啟山[6]、姜梅杰[2]等人的研究結(jié)果相一致，表明當(dāng)鮑曼不動(dòng)桿菌發(fā)生亞胺培南耐藥時(shí)，往往也在同時(shí)對大多數(shù)其他抗菌藥物產(chǎn)生了廣泛耐藥，且消毒劑在臨床的應(yīng)用也成為了鮑曼不動(dòng)桿菌發(fā)生耐藥的原因之一，提示應(yīng)當(dāng)注重抗菌藥物和消毒劑的合理使用及制定有效避免交叉感染的措施。

綜上所述，本院分離自臨床標(biāo)本的亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制與碳青霉烯酶耐藥基因OXA-23、OXA-51和氨基糖苷類耐藥基因ant(3'')-Ⅰ,aac (6')-Ⅰ、armA及耐消毒劑相關(guān)基因qacE△1有關(guān)，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)臨床院內(nèi)感染針對性措施的制定。