金一鋒，高巖松，王 琦，王萌萌，趙 迪，熊 毅，陳 陽(yáng)

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

草地早熟禾(PoapratensisL.)是優(yōu)質(zhì)的冷季型草坪草之一，被廣泛用于溫帶和寒溫帶，其具有較強(qiáng)的耐低溫、耐修剪、綠期較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[1]?，F(xiàn)階段園林城市綠化建設(shè)中草坪養(yǎng)護(hù)管理時(shí)期常面臨干旱、鹽脅迫、氮肥利用率低等情況，提升草坪草的耐旱、耐鹽、耐養(yǎng)分環(huán)境等可以一定程度上降低草坪草管理成本，探究草坪草響應(yīng)逆境脅迫信號(hào)的機(jī)制十分必要。蛋白激酶是植物逆境防御機(jī)制中的重要核心成分，其中蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶(SnRK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在植物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2-3]。SnRK家族可分為3類，分別為SnRK1、SnRK2、SnRK3，其中SnRK2和SnRK3是植物所特有的蛋白激酶，研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)等SnRK2s和SnRK3s家族成員積極參與ABA信號(hào)傳導(dǎo)及多種非生物脅迫[4-5]。

現(xiàn)有禾本科植物蛋白激酶SnRK相關(guān)研究主要集中在水稻、二穗短柄草(BrachypodiumdistachyonL.)、小麥等，但有關(guān)禾本科草坪草SnRK的功能研究鮮有報(bào)道。水稻SnRK2家族成員，又被命名為 SAPK(Osmotic stress/ ABA-activated protein kinase)，研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)OsSAPK4可以改善幼苗及成熟植株在鹽脅迫下的發(fā)芽及生長(zhǎng)發(fā)育情況[6]。Krzywińska等[7]研究表明，PP2CA可以與ABI1和SnRK2.4一起調(diào)節(jié)擬南芥根系生長(zhǎng)以適應(yīng)鹽脅迫。Szymańska等[8]研究表明，SnRK2.4可以調(diào)節(jié)鹽脅迫的幼苗中過(guò)氧化氫酶水平及其活性和抗壞血酸水平。馬鈴薯SnRK2.4基因受低溫、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)[9]。二穗短柄草多個(gè)SnRK2s家族成員受冷、干旱、鹽、ABA、ETH、H2O2脅迫的誘導(dǎo)[10]。

本試驗(yàn)以草地早熟禾為研究對(duì)象，克隆得到SnRK2.4基因，利用生物信息學(xué)分析其編碼序列特征，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析該基因的組織特異性，以及非生物脅迫中的表達(dá)模式，以期為揭示草地早熟禾SnRK2.4基因逆境應(yīng)答分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，這也將豐富草坪草SnRK2抗逆機(jī)制的相關(guān)研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理方法

試驗(yàn)于 2021年4—8月進(jìn)行，供試材料為草地早熟禾午夜Ⅱ號(hào)品種。選取試驗(yàn)地中長(zhǎng)勢(shì)較好的植株，根部洗凈后置于水培液中，每2 d澆灌1次1/2 Hoagland水培液，待培養(yǎng)14 d后進(jìn)行非生物脅迫處理。具體處理為：①干旱脅迫：1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中加入10% PEG6000，模擬干旱處理0，2，16 h，對(duì)其根部、葉部進(jìn)行取樣。②鹽脅迫處理：配置0，30，100，300 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。③氮素脅迫：采用NaNO3為氮源，配置3種氮素梯度的營(yíng)養(yǎng)液，NaNO3濃度分別為0，1.5，15.0 mmol/L NaNO3。④磷素脅迫：采用磷酸二氫鉀KH2PO4為磷源，配置3種磷素梯度的營(yíng)養(yǎng)液，KH2PO4濃度分別為0，0.01，1.00 mmol/L KH2PO4，鹽、氮素、磷素水培液均為每天更換，14 d后對(duì)整株材料進(jìn)行取樣，樣本均保存于-80 ℃。⑤ABA、BR處理：ABA濃度為5，15 mg/L，每天噴施于葉部，于0，7，21 d 取樣。BR濃度為0.1，1.0 mg/L，每天噴施于葉部，于0，7，21 d取樣，樣本均保存于-80 ℃。

1.2 草地早熟禾SnRK2.4基因的克隆及生物信息學(xué)分析

本研究參照植物總RNA提取試劑盒(TianGen，北京)提取供試材料的總RNA，并進(jìn)行總RNA濃度、純度OD值的檢測(cè)。以檢測(cè)合格后的總RNA為模板，采用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)獲得cDNA第一條鏈，用于草地早熟禾SnRK2.4基因的克隆。園林植物育種實(shí)驗(yàn)室前期獲得的草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI登錄號(hào)：PRJNA517968)作為基礎(chǔ)，結(jié)合GenBank公布的二穗短柄草SnRK2.4(NP_001304812.1)、水稻SnRK2.4(NP_001383791.1)，設(shè)計(jì)特異性引物SnRK2.4-F、SnRK2.4-R(表1)。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃ 變性30 s，退火58 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)；最終延伸72 ℃ 2 min，獲得草地早熟禾SnRK2.4基因序列。引物合成和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序均由生工生物工程股份有限公司(上海)完成。

本研究利用NCBI-ORF預(yù)測(cè)SnRK2.4開放性閱讀框，用NCBI CD-Search分析該蛋白保守結(jié)構(gòu)功能域；利用MEGA 7.0、MEME構(gòu)建SnRK2.4系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用ClustalW 進(jìn)行SnRK2.4編碼氨基酸同源性分析；利用 ProtParam分析基本理化性質(zhì)，用Motifscan 分析生物活性位點(diǎn)；利用SOPMA在線預(yù)測(cè)SnRK2.4蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 草地早熟禾SnRK2.4基因組織特異性及非生物脅迫表達(dá)模式分析

本研究提取草地早熟禾植株不同部位(根部、莖部、葉部、穗部)的RNA；提取干旱、鹽、氮、磷、ABA、BR脅迫后的草地早熟禾葉部RNA，以不同樣本的RNA模板反轉(zhuǎn)錄獲得第一條cDNA，作為qRT-PCR模板。qRT-PCR總反應(yīng)體系為50 μL，包含4 μL cDNA，2 μL Q-SnRK2.4-F，2 μL Q-SnRK2.4-R，25 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (TaKaRa)，17 μL ddH2O。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；內(nèi)參基因?yàn)閁BQ，qRT-PCR引物見表1。該試驗(yàn)生物學(xué)、試驗(yàn)重復(fù)各3次，采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 13.0、GraphPad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

表1 所需RT-PCR及qRT-PCR引物Tab.1 The primers used for RT-PCR and qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 草地早熟禾SnRK2.4基因編碼區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析

利用草地早熟禾cDNA為模板，以及引物SnRK2.4-F/R，PCR擴(kuò)增得到約為1 242 bp的條帶(圖1)，其包含一個(gè)1 092 bp開放閱讀框，共編碼363個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)SnRK2.4蛋白分子質(zhì)量為42.25 ku，分子式為C1845H2910N528O568S21，等電點(diǎn)為5.71。草地早熟禾SnRK2.4 屬于SRK/SAPK 家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，含有STKc_SnRK2結(jié)構(gòu)域(圖2)。將草地早熟禾SnRK2.4與多個(gè)植物SnRK2.4氨基酸進(jìn)行同源比對(duì)(圖3)，結(jié)果顯示，草地早熟禾SnRK2.4與二穗短柄草SnRK2.4(NP_001304812.1)、大麥SnRK2.4(XP_044977561.1)同源性最高，分別為90.91%，90.08%。利用NetPhos-3.1分析草地早熟禾SnRK2.4磷酸化位點(diǎn)，其包含16個(gè)絲氨酸、12個(gè)蘇氨酸和7個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。將草地早熟禾SnRK2.4及多個(gè)禾本科植物(二穗短柄草、大麥、長(zhǎng)穗偃麥草)SnRK2.4進(jìn)行蛋白生物活性位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，草地早熟禾SnRK2.4含有1個(gè)cAMP 和 cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(247—250 aa)，3個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(40—46 aa，94—102 aa，140—146 aa)，9個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(6—9 aa，96—99 aa，172—175 aa，222—225 aa，250—253 aa，285—288 aa，290—293 aa，319—322 aa，346—349 aa)，1個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)(110—115 aa)，1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)(119—131 aa)，1個(gè)蛋白激酶 ATP 結(jié)合區(qū)域(10—33 aa)，1個(gè)富含谷氨酸的區(qū)域(317—342 aa)(圖4)。圖5-A為草地早熟禾SnRK2.4蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其包含41.05% α-螺旋，39.12%不規(guī)則卷曲，14.88%延伸鏈和4.96%β-轉(zhuǎn)角，圖5-B為草地早熟禾SnRK2.4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。

圖1 草地早熟禾SnRK2.4 基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳Fig.1 Electropherogram of PCR-amplified products of SnRK2.4

圖2 草地早熟禾SnRK2.4氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Conserved domain analysis of SnRK2.4 in kentucky bluegrass

圖3 草地早熟禾與其他植物SnRK2.4的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of SnRK2.4 in kentucky bluegrass and other plants

Ⅰ.蛋白激酶ATP結(jié)合信號(hào)區(qū)；Ⅱ.絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)；Ⅲ.富含谷氨酸的區(qū)域；-.cAMP 和 cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；=.N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)；#.酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)；^.酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)。Ⅰ.Protein kinase ATP binding signal domain；Ⅱ.Serine/threonine protein kinase active site；Ⅲ.Glutamate-rich region；-.cAMP and cGMP-dependentprotein kinase phosphorylation site；=.N-Myristoylation site；#.Tyrosine kinase phosphorylation site；^.Casein kinase Ⅱphosphorylation site.

2.2 草地早熟禾SnRK2.4基因表達(dá)水平的分析

2.2.1 草地早熟禾SnRK2.4基因組織特異性 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定草地早熟禾不同組織部位的SnRK2.4相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，SnRK2.4基因相對(duì)表達(dá)量存在組織特異性(P<0.05)，由圖6可見，穗部SnRK2.4基因相對(duì)表達(dá)量最高，根部、莖部和葉部之間的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異，穗中相對(duì)表達(dá)量是葉部的23.91倍。

2.2.2 草地早熟禾SnRK2.4對(duì)逆境脅迫的響應(yīng) 由圖7-A可知，隨著10% PEG6000脅迫時(shí)間的增加，草地早熟禾SnRK2.4基因相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，16 h 的相對(duì)表達(dá)量是0 h的10.31倍。NaCl處理顯著促進(jìn)SnRK2.4基因的表達(dá)(P<0.05)，300 mmol/L NaCl>100 mmol/L NaCl>30 mmol/L NaCl>0 mmol/L NaCl(CK)，300 mmol/L NaCl的相對(duì)表達(dá)量是0 mmol/L NaCl的17.78倍(圖7-B)。研究表明，低濃度NaNO3氮素處理顯著抑制SnRK2.4基因的表達(dá)量(P<0.05)，15.0 mmol/L NaNO3>1.5 mmol/L NaNO3>0 mmol/L NaNO3(圖7-C)。由7-D可知，與適磷組(1.0 mmol/L KH2PO4)相比，草地早熟禾SnRK2.4積極響應(yīng)無(wú)磷環(huán)境(0 mmol/L KH2PO4)，其中0 mmol/L KH2PO4處理組的表達(dá)量是1.0 mmol/L KH2PO4的4.49倍。本研究結(jié)果表明，ABA、BR濃度及處理時(shí)間均顯著影響SnRK2.4的表達(dá)。SnRK2.4的相對(duì)表達(dá)量隨著5mg/L ABA誘導(dǎo)天數(shù)的增加顯著上調(diào)，即21 d>7 d>0 d，但隨15 mg/L ABA誘導(dǎo)天數(shù)的增加，SnRK2.4基因呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，7 d>21 d>0 d(圖7-E)。由圖7-F 可知，0.1 mg/L 及1.0 mg/L BR誘導(dǎo)期間，SnRK2.4相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，21 d>0 d>7 d，可見，高濃度1.0 mg/L BR的誘導(dǎo)更有利于SnRK2.4基因的表達(dá)。綜上，草地早熟禾SnRK2.4基因可以積極響應(yīng)干旱、鹽、氮、磷、ABA和BR等非生物脅迫。

圖5 草地早熟禾SnRK2.4蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary and tertiary structure of SnRK2.4 protein in kentucky bluegrass

不同小寫字母表示組織部位中基因表達(dá)差異顯著 (P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences among tissue(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

本研究利用RT-PCR方法克隆獲得草地早熟禾蛋白激酶SnRK2.4基因，其開放閱讀框與二穗短柄草、大麥的SnRK2.4高度同源。與SnRK3家族成員相比，SnRK2包含的成員數(shù)量較少，有報(bào)道水稻、大麥、二穗短柄草等禾本科的SnRK2家族大多數(shù)包含10個(gè)成員，SnRK2s主要具有一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)Ser/Thr激酶結(jié)構(gòu)域，這與本研究結(jié)果一致[11-12]。草地早熟禾SnRK2.4蛋白生物活性位點(diǎn)包含酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)、cAMP 和 cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)等，這與二穗短柄草、大麥、長(zhǎng)穗燕麥草分析結(jié)果一致，但富含谷氨酸的區(qū)域在二穗短柄草未發(fā)現(xiàn)，可見禾本科植物中SnRK2蛋白激酶成員結(jié)構(gòu)有一定差異。SnRK2是植物特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，其多種磷酸化位點(diǎn)在逆境脅迫過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制起重要作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，N-肉豆蔻?；饔梦稽c(diǎn)是植物抵抗逆境環(huán)境時(shí)調(diào)節(jié)膜靶向和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要區(qū)域[14]。cAMP 依賴性蛋白激酶 (PKA)或 cGMP 依賴性蛋白激酶 (PKG)的激活促進(jìn)蛋白酶體功能[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，二穗短柄草BdSnRK2.4積極響應(yīng)干旱、NaCl脅迫，隨著PEG處理時(shí)間的增加，BdSnRK2.4相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，NaCl處理組的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于未處理組[10]，這均與本研究結(jié)果一致。McLoughlin等[16]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥SnRK2.4 和SnRK2.10 是擬南芥根中鹽脅迫下活化最快的蛋白激酶之一。另外，鹽脅迫下擬南芥SnRK2.4 和 SnRK2.10可以參與調(diào)節(jié) ROS 動(dòng)態(tài)平衡[7]。可見，SnRK2.4 可作為植物鹽脅迫適應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮一定作用。Lou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在水稻OsSnRK2.2可以調(diào)節(jié)硝酸鹽相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體NRT1.1進(jìn)而促進(jìn)硝酸鹽的吸收與同化。Su等[18]研究發(fā)現(xiàn)，缺氮條件下多個(gè)擬南芥SnRK2s家族成員參與ABA 信號(hào)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)。本研究中，無(wú)氮、低氮環(huán)境抑制草地早熟禾SnRK2.4基因的表達(dá)，但是無(wú)磷環(huán)境中促進(jìn)該基因的表達(dá)，可見營(yíng)養(yǎng)環(huán)境顯著影響草地早熟禾SnRK2.4的表達(dá)水平。Joo等[19]研究發(fā)現(xiàn)，OsbZIP42是一個(gè)ABA信號(hào)傳導(dǎo)和干旱脅迫耐受性的重要的正調(diào)節(jié)因子，OsbZIP42 的激活主要依賴于OsSnRK2.4。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)小麥TaSnRK2.4基因可顯著提高擬南芥的抗旱、抗鹽能力[20]，TaSnRK2.4具有改善千粒質(zhì)量和應(yīng)對(duì)非生物脅迫的潛力[21]。姜花(Hedychiumcoronarium)在ABA、IAA處理下HcSnRK2.2、HcSnRK2.4和HcSnRK2.9基因的相對(duì)表達(dá)量顯著增加[22]。ABA、ETH處理顯著影響多個(gè)二穗短柄草BdSnRK2家族成員，如BdSnRK2.2、BdSnRK2.4，玉米(ZeamaysL.)ZmSnRK2.4也可以被ABA誘導(dǎo)激活[9，23]，本研究也得到相似結(jié)果。草地早熟禾蛋白激酶SnRK2.4基因克隆與非生物脅迫下表達(dá)分析有利于進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的功能。綜上，草地早熟禾SnRK2.4積極響應(yīng)非生物脅迫，這為豐富SnRK2家族在逆境脅迫中的作用和潛在應(yīng)用有價(jià)值提供理論基礎(chǔ)。