林 靜，林建新，張 揚，盧和頂，陳山虎，廖長見

(福建省農業(yè)科學院 作物研究所，福建省特色旱作物品種選育工程技術研究中心，福建 福州 350013)

鮮食玉米與普通玉米相比具有甜、糯、嫩、香等特點，營養(yǎng)較高富含維生素和多種微量元素，所以鮮食玉米具有很高的經(jīng)濟和商品價值。隨著我國人民生活水平的逐步提高，市場對鮮食玉米的需求量也越來越大，然而我國對鮮食玉米品種的研發(fā)和供應仍存在很大缺口，因此，提升鮮食玉米品質，增加鮮食玉米的市場供應，對保障我國國民生活水平具有重要意義。福建省地處東南山區(qū)，可用耕地面積十分匱乏，素有“八山一水一分田”之稱，開發(fā)經(jīng)濟價值相對較高的農作物對提升當?shù)剞r民收入具有重要意義，因此，鮮食玉米成為福建省可選的特色經(jīng)濟作物之一。

鮮食玉米具有即食的特點，其保鮮期和上市期都很短。根據(jù)播種時期，鮮食玉米在福建省可分為春、秋兩季種植，而提前上市可以顯著提高入市時的銷售價格。然而對于春播的鮮食玉米，種植太早苗期遇低溫會導致減產(chǎn)和品質下降，而延后種植又會導致入市價格不理想。玉米是一個對溫度非常敏感的作物[1]，有研究表明，玉米適宜生長的高溫在25～28 ℃，適宜的低溫在5～18 ℃，高于或低于這個區(qū)間的溫度其產(chǎn)量和品質都會受到顯著影響[2]。例如通過設置不同播種期研究玉米生長發(fā)育進程發(fā)現(xiàn)，玉米的生長速率與溫度密切相關，平均氣溫每升高1 ℃，出苗速率提升17%，營養(yǎng)生長速率提升5%；平均氣溫每降低0.7 ℃，玉米成熟期將延遲7 d，發(fā)生一般低溫冷害，玉米單產(chǎn)減少8%；氣溫下降1 ℃，生育期延遲10 d，發(fā)生嚴重低溫冷害，減產(chǎn)10%以上[3]，低溫脅迫還會導致玉米籽粒灌漿期縮短，從而導致空稈、禿頂及癟粒增多等現(xiàn)象[4]。此外，低溫還會影響細胞分化的速度，受低溫影響葉片大小和數(shù)目都會顯著減少，即使后期溫度回升，由于葉片面積和數(shù)量不足無法支撐苗期的快速發(fā)育，也會影響玉米產(chǎn)量和品質[5-6]。

植物受冷害脅迫后應激反應會表現(xiàn)在多種形式上，例如活性氧(ROS)升高以及一些具有保護作用小分子的合成等[7]。在分子機制上普遍認為，冷害會顯著影響植物的光合系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)的活性，進一步影響植物的光合作用，而光合作用的減弱將會影響植物能量的合成和儲備，從而降低植物對冷害的耐受性，但不同的植物對冷害的耐受性也存在顯著差異[8]。在應對冷害上，植物激素和MAPK兩大信號通路起著關鍵的調控作用，其中鈣結合蛋白、蛋白激酶和蛋白磷酸酶等又是這2個通路中的一些關鍵因子[9-10]，但對于耐冷的遺傳調控機制研究相對較少。而相關耐冷機制的研究在鮮食玉米上也非常有限[1]。玉米的耐冷是一個復雜的性狀，生理機制上冷害脅迫會影響玉米的一些主要農藝性狀，但調控玉米主要農藝性狀的主效基因卻不能顯著影響玉米的耐冷特性[11]，暗示著玉米耐冷機制是需要多基因和信號通路協(xié)調作用，因此，單獨或局部研究某個基因或調控通路很難全面解析耐冷性狀的分子機制。關于玉米耐冷的多基因和網(wǎng)絡協(xié)調調控機制的研究也在逐步開展，如Sobkowiak等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對于冷害脅迫最先響應的是光合系統(tǒng)，隨后細胞結構和發(fā)育過程的調控通路也會隨之發(fā)生變化，但其具體的調控通路和關鍵調控基因仍不明確。

本研究以福建省農業(yè)科學院作物研究所培育的耐寒鮮食玉米品種閩甜6855為材料，利用轉錄組學的方法解析受冷害脅迫后，耐寒玉米品種在轉錄水平上的基因組表達量變化，以期從宏觀的角度初步揭示玉米抗寒過程中涉及的關鍵調控網(wǎng)絡和基因，為深入解析玉米抗寒的分子機制提供參考數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗中使用材料為福建省農業(yè)科學院作物研究所自主選育的甜玉米品種閩甜6855，在以往栽培年份中表現(xiàn)出較好的耐寒性。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 試驗中使用的玉米材料釆用盆栽方式種植培養(yǎng)，在室外正常培養(yǎng)玉米至二葉一心時，選擇無病、健壯、生長勢均勻的幼苗置于25 ℃培養(yǎng)箱中預處理24 h，隨后置于5 ℃低溫培養(yǎng)箱中進行冷處理，每個處理20株，3 次生物學重復。以未進行低溫處理的玉米葉片作對照，每隔24 h取樣1次，冷處理最長至72 h。每次取樣隨機選取5株，剪取相同部位的葉片置于液氮速凍，然后保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 RNA 的提取和純化 測序中使用的葉片總RNA利用Total Plant RNA Extraction kit(Karroten，Beijing，中國)進行提取。提取后RNA 的質量檢測方法如下：電泳檢測：用DEPC水配制1×TAE電泳緩沖液，制作2%瓊脂糖凝膠，120 V 電泳檢測，觀察RNA條帶是否降解；分光光度計檢測：取2 μL RNA溶液，用 NanoDrop 2000核酸蛋白檢測儀檢測RNA 濃度及純度，當RNA濃度 ≥300 ng/μL、 OD260/280= 2.0～2.2、OD260/230≥1.0時，表示質量合格，可以進行后續(xù)試驗。

1.2.3 文庫的構建、測序及差異分析 轉錄組文庫的構建由北京諾禾致源生物科技有限公司進行流程化的制備，合格后在Nova-seq 6000測序儀上進行雙末端測序。對下機的 raw reads利用 fastp[13]進行質控，過濾低質量數(shù)據(jù)得到。將得到的 Clean Date 使用 TopHat version 2.0.10 與玉米參考基因組B73比對，進行基因表達量的計算。獲得基因的 FPKM 值，利用 edgeR的方法尋找差異表達基因(Differentially expressed genes，DEGs)。在篩選差異表達基因時，以P<0.05 且 Fold Change≥2 作為差異標準。

1.2.4 主成分(PCA)和KEGG注釋分析 樣品間主成分(PCA)分析和KEGG注釋分析均在基迪奧云分析平臺(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/diffanalysis)進行，分析使用的注釋文件在https://phytozome-next.jgi.doe.gov/網(wǎng)站下載。韋恩分析和表達聚類分析根據(jù)響應基因的FPKM值，利用TBtools進行分析繪制。

2 結果與分析

2.1 不同處理樣本間的主成分分析(PCA)

為了明確耐寒鮮食玉米閩甜6855在不同耐冷處理時長后轉錄組樣本間的重復性及整體變化趨勢，以12個轉錄組樣本所有注釋基因的FPKM值為參數(shù)進行樣本間的主成分分析(PCA)，結果顯示(圖1)，橫坐標和縱坐標分別可以解釋整體樣本變化的57.5%和28.5%，可解釋總體變異率為86.0%，且樣本重復間呈現(xiàn)顯著聚集趨勢，說明樣本間重復性較好，可以用于后續(xù)差異分析。結果還顯示，CK(即0 h)時間點的樣本與24，48，72 h點樣品距離較遠，而CK之外的樣品間相對距離較近，表明閩甜6855受冷害脅迫后前期響應比較迅速，但隨著耐冷時間的變化，基因表達也存在變化，但變化趨勢逐漸減少。

圖1 低溫處理樣品表達量的PCA分析Fig.1 PCA analysis of expression levels for samples treated with low temperature

2.2 不同處理樣本間的基因表達差異分析

為了進一步明確閩甜6855受冷害脅迫后在轉錄水平上基因表達量的變化，對不同時間點的基因表達量進行差異分析，結果顯示(圖2)，整體上閩甜6855在低溫處理前后差異基因為4 000～7 000個，而不同時長低溫處理樣本間差異基因較少，為100～2 000個，表明低溫是引起基因差異主要因素，且對低溫脅迫的響應主要在前期。不同時間點對比結果顯示(圖2)，與處理前CK相比，閩甜6855受冷害處理后24 h點分別有1 952，1 882個基因上調和下調；處理48 h后，上調和下調基因增多，分別達到3 543，3 265個；而在處理72 h后，上調基因變少，下調基因增多，分別為2 178，4 913個。但從整體上分析，隨著處理時間變長，整體差異基因呈現(xiàn)增多的趨勢。此外。處理24，48，72 h后樣品之間相比，差異基因顯著減少。尤其是處理48，72 h，上調和下調基因分別僅為10，103個。結果表明，閩甜6855的多數(shù)差異基因在冷害處理前期即具有顯著響應，處理后期新增響應基因數(shù)目顯著減少。而處理48，72 h后，樣品間差異基因幾乎沒有了，表明低溫是造成差異的主要因素，而低溫處理時長是次要因素，此外閩甜6855對冷害脅迫的響應在48 h內基本完成，暗示著快速應對冷害脅迫可能是閩甜6855能夠耐寒的基本特性之一。

圖2 低溫處理后不同時間點樣品表達量差異分析Fig.2 Difference analysis of expression in samples at different time points after low temperature treatment

進一步分析差異基因在不同處理樣本間的變化，對不同樣本間的差異基因進行韋恩分析，結果顯示(圖3)，處理24 h的上調和下調的基因與處理48，72 h的差異基因相比具有顯著差異，其中24 h樣本中上調和下調的1 952，1 882個差異基因中，分別有1 925，1 851個為特異表達，僅在24 h樣品中上調和下調表達，僅有27，31個基因也在其他時間點樣本中上調表達和下調表達；與此不同，48，72 h樣本中，共同上調和下調的基因分別為2 827，1 882個，占各自樣本差異基因總數(shù)的50%以上，甚至90%左右。結果表明，閩甜6855在受冷害脅迫后不同階段的響應基因存在著顯著不同，尤其前期響應比較特異，后期響應存在一定共性。

圖3 低溫處理后不同時間點樣品表達量差異Veen圖Fig.3 Veen plot of differences in expression levels of samples at different time points after low temperature treatment

2.3 參與抗寒脅迫基因KEGG通路分析

為了深入探究閩甜6855中參與抗寒脅迫的調控通路，對不同時間點響應進行KEGG通路注釋分析，結果顯示(圖4)，在冷害處理24，48 h后，絕大多數(shù)的差異基因參與了代謝途徑(Metabolic pathways)和次生代謝產(chǎn)物的合成途徑(Biosynthesis of secondary metabolites)，處理24(48)h分別有483(798)，268(442)個差異基因參與了2種途徑。但在處理72 h后，參與2種代謝通路的響應基因幾乎消失。表明閩甜6855中抗寒需要的一些代謝物主要在72 h之前完成合成，并且不需要持續(xù)合成。植物激素信號轉導(Plant hormone signal transduction)和MAPK是與抗病蟲及抗逆脅迫緊密相關的2個信號通路，本結果還顯示，在冷害處理的不同時間點分別有40，66和67個差異基因參與了MAPK信號調控途徑；分別有55，91，102個差異基因參與了植物激素信號轉導信號調控途徑，差異基因有增多的趨勢，表明抗寒脅迫過程中這2個信號通路積極響應。此外，結果還顯示，在低溫處理后24，48 h，分別有54，74個基因參與了植物病原菌互作(Plant-pathogen interaction)調控通路，推測除MAPK和植物激素信號轉導調控途徑外，在抗病蟲和抗逆境脅迫的通路上也存在著重疊或共有調控途徑。

A、B、C分別代表低溫處理24，48，72 h的樣品差異基因的KEGG分析；q value即q值，是對p值的校正。A, B, and C. The KEGG analysis of differential genes in samples treated with low temperature for 24, 48, and 72 h, respectively; q value is the correction of the p value.

2.4 參與抗寒脅迫MAPK信號通路的變化分析

為了深入了解閩甜6855的耐寒分子機制 ，對MAPK信號通路上的調控基因進行進一步分析，結果顯示(圖5)，受冷害處理后MAPK信號通路上的大部分基因發(fā)生了顯著的變化。在處理24，48，72 h后，MAPK信號通路上分別有10，23，44個基因下調，分別有30，43，33個基因上調。從不同時間點上分析，冷害處理24，48 h后，在MAPK信號通路的多數(shù)節(jié)點上均出現(xiàn)了顯著上調，結果表明，閩甜6855在受冷害48 h內即出現(xiàn)顯著響應，隨后開始逐漸降低。此外，從數(shù)量上分析，處理72 h比24 h上調基因數(shù)目要多，分別為33，30個，但上調基因的類型要顯著少于24 h，表明24 h對冷害的響應更為廣泛。試驗結果還顯示，在與冷害直接相關的途徑上，MKK1、MKK2和MKK4/6家族一些差異基因在受冷害處理后均出現(xiàn)了顯著上調或下調，說明這些基因在應對冷害脅迫中均起到了積極的響應。

圖5 冷害脅迫后MAPK信號通路上基因表達變化Fig.5 Expression variation of MAPK signaling pathway in cold stress treatment

2.5 參與抗寒脅迫植物激素信號轉導信號通路的變化分析

為了探究植物激素信號轉導信號通路參與抗寒脅迫的關鍵基因，對3個時間點該信號通路上的基因變化趨勢進行分析，結果顯示(圖6)，在處理24，48，72 h后，植物激素信號轉導信號通路上分別有20，34，69個基因下調，分別有35，57，33個基因上調。與MAPK信號通路變化相比，不同時間點間的基因表達變化差異相對較少，一些關鍵調控基因例如ARF、A-ARR、JAZ及PP2C在不同時間點均有顯著上調表達，這類基因主要參與植物細胞增大、細胞分化、莖的生長或脅迫響應等過程，表明這類基因可能隨著溫度的降低持續(xù)表達，以維持植物在低溫下的正常生長和發(fā)育。

圖6 冷害脅迫后植物激素信號轉導網(wǎng)絡通路上基因表達變化Fig.6 Expression variation of plant hormone signal transduction signaling pathway in cold stress treatment

2.6 冷害脅迫對晝夜節(jié)律信號通路(Circadian rhythm-plant)基因的影響

為了進一步明確冷害脅迫的廣泛影響，對受脅迫后調控晝夜節(jié)律信號通路上的差異基因進行分析，結果顯示(圖7)，該信號通路上共有37個基因發(fā)生了顯著變化。從初始表達總量上分析，3個家族的4個差異基因GI(Zm00001d008826和Zm00001d039589)，CRY1(Zm00001d003477)和PRR7(Zm00001d047761)在冷脅迫處理前初始表達量相對較高，F(xiàn)PKM值在78.42～243.32，但受脅迫后4個基因均出現(xiàn)了顯著降低，F(xiàn)PKM值下降到16.83～117.40；與此相反，6個家族的7個差異基因PRR5(Zm00001d021291)、CHS(Zm00001d052673)、HY5(Zm00001d015743和Zm00001d039658)、LHY(Zm00001d049543)、PIF3(Zm00001d024783)和TOC1(Zm00001d017241)在冷害處理后前初始表達量相對較低，F(xiàn)PKM值在1.69～24.92，受冷害脅迫后基因表達量顯著上調，F(xiàn)PKM值最高值均超過了50。結果暗示著11個基因在植物受脅迫后調節(jié)晝夜節(jié)律信號通路變化中起主要作用。除此之外，還有9個基因冷害處理前初始表達量FPKM值在18.85～33.19，冷害脅迫72 h后出現(xiàn)顯著降低，表達量FPKM值在1.79～9.05，說明這些基因在調控晝夜節(jié)律信號通路變化中也起著重要的作用。

圖7 晝夜節(jié)律信號通路基因的差異分析Fig.7 Differential analysis of genes in circadian rhythm-plant signaling pathway

3 結論與討論

3.1 耐冷鮮食玉米閩甜6855的推廣前景

福建省地處東南山區(qū)，可用耕地面積少，機械化程度低，人工成本高，因此適宜開展一些高附加值的農業(yè)經(jīng)濟。隨著人們對鮮食玉米需求的逐漸增加，其經(jīng)濟價值越來越高，然而我國鮮食玉米整個種業(yè)現(xiàn)狀有待進一步發(fā)展，主要不足有兩點：良種推廣滯后和配套的產(chǎn)業(yè)化程度不高[14]。目前，顯示玉米產(chǎn)業(yè)主要集中在南方，以春玉米為主。但由于鮮食玉米上市期非常短，容易形成扎堆上市，從而導致貨豐價廉的現(xiàn)象[15]。春播鮮食玉米面臨一大問題即苗期低溫脅迫，尤其是倒春寒引起的大降溫容易導致鮮食玉米的大面積減產(chǎn)或品質下降，因此，農民在種植過程中為了避免類似災害發(fā)生，多數(shù)農民會選擇在清明天氣維穩(wěn)后開始播種。閩甜6855是福建省農業(yè)科學院作物研究所培育的甜玉米品種，于2016年5月通過福建省農作物品種審定委員會審定(品種審定號：閩審玉2016003)。在前期福建和廣西等田間試驗中發(fā)現(xiàn)，閩甜6855播種期可提前至3月中下旬，且苗期如果遭遇一般年份的凍害不會造成顯著的減產(chǎn)或品質下降，呈現(xiàn)較好的抗寒特性。因此，在推廣應用的過程中可以適當強調其抗寒特性，推薦提前播種達到提前收獲提前上市的目的，避開上市高峰期，提高入市價格。但在推廣的過程中也應繼續(xù)關注其耐冷的生物學特性，研發(fā)配套的栽培技術?？傊购贩N閩甜6855的推廣有利于完善鮮食玉米的產(chǎn)業(yè)化結構，提升整個產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。

3.2 耐寒研究采樣時期和處理溫度的選擇

本研究采用的主要技術手段是轉錄組分析，而對于轉錄組研究來說，正確處理對試驗至關重要。發(fā)育時期、處理溫度、處理時間等均是本研究中考慮的重點。低溫是影響鮮食玉米的重要氣候條件，春玉米苗期又非常容易遭受驟冷降溫的脅迫，從而嚴重影響發(fā)芽率和后期長勢，而鮮食玉米與普通玉米相比受影響更大[16]。玉米受冷害脅迫后首先表現(xiàn)在膜上，膜系統(tǒng)結構被破壞后，細胞質膜透性增強，電解質外滲，葉片就會出現(xiàn)萎蔫等不可逆的脅迫癥狀[17]?；谝陨涎芯勘尘埃驹囼炦x擇玉米苗期進行后續(xù)研究分析。此外，在選擇溫度和處理時長上，在前期通過設置不同溫度的梯度對閩甜6855及其親本進行冷害處理，當溫度降低至5 ℃，處理到72 h后，閩甜6855表現(xiàn)出比雙親優(yōu)良的抗寒性，雙親均出現(xiàn)了不同程度的萎蔫，說明冷害處理72 h后，其細胞膜結構已經(jīng)被破壞。相比之下，閩甜6855則無顯著影響。因此，本研究的轉錄組選擇時期主要是苗期，溫度設置為5 ℃，處理最長時間為72 h，以此來保證獲得的轉錄組數(shù)據(jù)能夠真實反映冷害脅迫后轉錄層面的變化趨勢。

3.3 冷害脅迫與植物-病原互作通路變化

植物抗逆境脅迫是一個復雜的過程，其中逆境脅迫又可以分為生物和非生物逆境脅迫。生物逆境脅迫又包含病毒、細菌和真菌等脅迫，非生物主要包括干旱、鹽、冷、高溫等環(huán)境脅迫。在應對逆境脅迫的過程中MAKP和植物激素信號轉導信號通路起著重要的作用，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，冷害脅迫后，這2個信號通路均富集了大量差異基因。但在植物-病原互作通路上也富集了相對較多的差異基因。通過分析參與這3種信號通路的差異基因發(fā)現(xiàn)，存在著相同的調控基因。例如，鈣調蛋白磷酸酶(Caldneurin)是依賴Ca2+/鈣調素調節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在MAKP和植物激素信號轉導通路中起關鍵調控作用。而在植物-病原互作通路中也存在此類基因的參與，而本研究中的植物-病原互作通路上也發(fā)現(xiàn)了此類結構基因顯著富集。除此之外，類似WRKY、PR1等基因在3種信號調控通路中也廣泛存在并顯著富集，暗示著植物在抗生物和非生物脅迫過程中，存在著相似或相通的調控通路，這對植物應對外界環(huán)境脅迫具有重要的意義。

3.4 冷害脅迫與植物晝夜節(jié)律變化

玉米是典型的積溫作物，溫度能夠顯著影響玉米的生長發(fā)育進程[18]。晝夜節(jié)律是調節(jié)植物發(fā)育的一個重要信號通路，晝夜節(jié)律控制植物多種生命活動，如胚軸伸長、葉片發(fā)育及開花期等[19]。植物響應低溫途徑的核心是CBF蛋白，CBF蛋白通過轉錄激活COR基因，從而促進初級和次級代謝產(chǎn)物積累，增加與抗凍相關蛋白的合成來提高植物的低溫耐受力[20]，研究發(fā)現(xiàn)，CBF同時受低溫誘導和生物鐘控制，它在白天被誘導表達，夜晚則幾乎沒有表達，暗示著生物鐘對植物寒冷脅迫應答至關重要[19，21]。其中一些生物鐘基因也被證實與CBF存在調控作用。例如，CCA1/LHY可以直接和CBF啟動子結合，正調控該基因的表達[22]，PRR5/7/9是CBF的負調控因子[23]，TOC1和EC復合物同樣通過和啟動子結合來抑制CBF3表達，這一調控也影響CBF1和CBF2的表達[24]。本研究結果也顯示，晝夜節(jié)律通路上的基因發(fā)生了顯著變化，包括已明確與冷害脅迫相關的LHY、PRR及TOC等家族的基因，這些結果暗示著閩甜6855在應對冷害脅迫的過程中可能是通過晝夜節(jié)律通路調控抗寒信號CBF蛋白的表達，從而促進一些與抗寒相關的蛋白合成。而結果還顯示，在冷害處理24，48 h后，代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的合成途徑富集了大量差異基因，這可能與CBF核心蛋白的調控相關，并且這種蛋白合成在非常短的時間(72 h內)內完成，因此可以快速使其適應低溫的環(huán)境。

本研究利用轉錄組學對耐寒鮮食玉米品種閩甜6855在受低溫脅迫后轉錄水平的變化進行分析，結果表明，閩甜6855受冷害脅迫后前期響應比較迅速，基本在48 h內即可完成轉錄水平的調控。受冷害脅迫后，主要抗性信號通路植物激素信號轉導、MAPK和植物病原互作等通路都會積極響應，此外，晝夜節(jié)律也出現(xiàn)了積極響應，表明晝夜節(jié)律對甜玉米抗寒具有重要作用。