陳瑤瑤 趙曉南 周潔楠 張美玲 孫艷紅 羅春蕊

云南省疾病預(yù)防控制中心急性傳染病防制所，昆明 650022

禽流感是由禽流感病毒（AIV）引起各種家禽及野生禽類發(fā)生疫病的傳染性疾病。某些AIV亞型可以突破宿主屏障感染人類，我國先后出現(xiàn)人感染H5N1、H7N9、H10N8、H5N6和H7N4等禽流感病例的報(bào)道[1-7]，對人類健康和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。云南省自2005年首次發(fā)生人感染H5N6高致病性禽流感病例以來[8]，先后出現(xiàn)人感染H5N6、H5N1、H7N9和H9N2等病例，疫情防控形勢嚴(yán)峻。研究表明，禽類接觸史是人感染AIV的重要因素[9]，涉禽環(huán)境是AIV傳播及重配產(chǎn)生新亞型的主要場所[10]。長期監(jiān)測涉禽環(huán)境中的AIV污染狀況，有利于相關(guān)部門了解AIV的流行狀況和變異情況，對本地人感染禽流感的預(yù)警提供重要參考。為此，本文分析了2015—2021年云南省涉禽環(huán)境中AIV的污染狀況，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、監(jiān)測點(diǎn)的設(shè)置及樣本類型

在云南省16個(gè)地區(qū)選擇轄區(qū)內(nèi)城鄉(xiāng)活禽市場、活禽批發(fā)市場、家禽規(guī)模養(yǎng)殖戶、家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)和野生禽鳥棲息地5類場所開展監(jiān)測。根據(jù)《職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測方案（2011年版）》的要求，組織全省16個(gè)地區(qū)在轄區(qū)范圍內(nèi)，選取曾經(jīng)發(fā)生過人和/或動(dòng)物禽流感疫情；水體分布比較密集，水禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)；候鳥棲息地或候鳥遷徙路線的地區(qū)作為監(jiān)測地區(qū)，每個(gè)監(jiān)測地區(qū)選擇城鄉(xiāng)活禽市場、活禽批發(fā)市場、家禽規(guī)模養(yǎng)殖戶、家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)和野生禽鳥棲息地5類場所開展監(jiān)測。監(jiān)測時(shí)間為每年10—12月。

采集樣本類型包括監(jiān)測點(diǎn)的籠具表面擦拭樣本、案板表面擦拭樣本、禽類糞便樣本、清洗禽類的污水樣本及禽類飲水樣本等。少量的禽類咽、肛拭子列入其它類別。

二、樣本的采集、處理及運(yùn)輸

1.樣本采集

水樣本：在禽類活動(dòng)或籠具旁的水溝或水池、清洗禽類的污水盆或桶、禽類飲水槽的不同部位收集水樣本5～10 mL置于15 mL外螺旋蓋的管內(nèi)。水樣本到實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)在采樣管中加入抗生素和0.5%牛血清白蛋白（BSA），再進(jìn)行分裝?；\具表面擦拭樣本：每個(gè)籠具采集1份樣本放在單獨(dú)的采樣管中。用蘸有采樣液的帶有聚丙烯纖維頭的拭子擦拭籠具表面禽類最常接觸的3～5個(gè)不同部位（包括籠具底部），然后將擦拭過的拭子放入含5 mL采樣液的采樣管中，尾部棄去；也可以用多個(gè)拭子充分擦拭籠具表面后放到一個(gè)采樣管中。案板表面擦拭樣本：如果宰殺或擺放禽肉使用不同的案板，可采集擦拭樣本放到不同的采樣管中。糞便樣本：從禽舍或環(huán)境中采集新鮮禽類糞便樣本3～5 g，放入含5 mL采樣液的采樣管中。

以上采集的樣本在無菌條件下反復(fù)吹打，以便打碎固體物質(zhì)，置4℃待其自然沉淀30 min，也可3 000 r/min(離心半徑為16.8 cm)離心10 min，取上清進(jìn)行分裝。

2.樣本運(yùn)輸

樣本采集后在4℃條件下24 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室收到樣本后立即進(jìn)行樣本處理，將樣本分為3份，1份用于核酸檢測，1份留樣，1份備用送檢（至少1.5 mL）。留樣樣本要求在－70℃或以下保存。樣本運(yùn)輸時(shí)遵守國家生物安全的有關(guān)規(guī)定。

3.實(shí)驗(yàn)室檢測

實(shí)驗(yàn)室接收樣本后48 h內(nèi)進(jìn)行核酸提取和Real-time PCR核酸檢測。樣本置于振蕩器充分振蕩，離心后吸取上清，使用江蘇碩世全自動(dòng)核酸提取儀和核酸提取試劑盒（SDK60104）進(jìn)行核酸提取，使用國家流感中心提供的A、H9、H7、H9引物探針進(jìn)行進(jìn)一步分型[11]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將監(jiān)測數(shù)據(jù)錄入Excel2007建立數(shù)據(jù)庫，SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用份數(shù)和率表示，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、檢測基本情況

2015—2021年全省共檢測環(huán)境樣本11 033份，AIV核酸陽性樣本2 951份，平均陽性率為26.75%。2021年的核酸陽性率最高，為37.46%（354/945）；2015年核酸陽性率最低，為21.90%（230/1 050）。不同年份的AIV核酸陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=387.21，P＜0.001）。從亞型分型結(jié)果來看，陽性數(shù)由高到低分別是：H9亞型、未分型、H5亞型、混合型和H7亞型。具體結(jié)果見表1。

表1 云南省禽流感外環(huán)境檢測結(jié)果(2015—2021年)

二、不同場所及樣本AIV檢測結(jié)果

表2顯示，不同監(jiān)測場所中，樣本陽性率由高至低分別為：城鄉(xiāng)活禽市場（36.08%，2 717/7 531）、活禽批發(fā)市場（35.06%，149/425）、家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)（4.26%，37/869）、家禽規(guī)模養(yǎng)殖戶（2.60%，44/1 690）和野生禽鳥棲息地（0.77%，4/518）。不同監(jiān)測場所AIV核酸陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=63.87，P＜0.001）。各個(gè)監(jiān)測場所中均為H9亞型檢出數(shù)量最多。

6種不同類型的外環(huán)境樣本檢測結(jié)果顯示，清洗禽類污水樣本的核酸陽性率最高，達(dá)45.50%（825/1 813）；其次是案板表面樣本，陽性率為34.32%（592/1 725）；其他類型的樣本（禽類咽、肛拭子等）陽性檢出率最低，為13.65%（68/498）。6種類型樣本AIV核酸陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=97.68，P＜0.001）。具體結(jié)果見表2。

表2 云南省不同場所、不同樣本禽流感病毒檢測結(jié)果(2015—2021年)

三、不同州（市）禽流感外環(huán)境檢測結(jié)果

表3顯示，云南省16個(gè)地區(qū)AIV核酸陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=764.28，P＜0.001）。AIV核酸陽性率前3位的州（市）分別為保山市（45.27%，263/581）、文 山 州 （39.68%，269/678）和 怒 江 州（36.30%，212/584）。

表3 云南省各地區(qū)禽流感外環(huán)境檢測結(jié)果（2015—2021年）

討 論

禽流感的流行給養(yǎng)禽業(yè)和人類健康均帶來了巨大損失。人感染高致病性禽流感時(shí)有發(fā)生，有必要進(jìn)行涉禽環(huán)境樣本監(jiān)測，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)前AIV污染現(xiàn)狀，更深入地了解目前監(jiān)管的薄弱環(huán)節(jié)。

一、云南省涉禽環(huán)境中AIV污染情況仍需關(guān)注

2015—2021年云南省涉禽環(huán)境樣本中A型禽流感病毒核酸的平均陽性率為26.75%，表明涉禽環(huán)境中AIV污染仍較為嚴(yán)重。近年，云南省環(huán)境樣本中AIV陽性率整體呈上升趨勢，可能與監(jiān)測敏感性和試劑靈敏度提升有關(guān)，另外各年份各地區(qū)的監(jiān)測點(diǎn)和樣本類型的變化，也會(huì)導(dǎo)致陽性率的改變。全省H9亞型陽性構(gòu)成比占73.33%，在各種樣本類型中均有分布，提示H9亞型在云南省的涉禽環(huán)境中分布廣泛，提高了與其他流感病毒發(fā)生重配的可能性，也為新的人感染AIV的形成奠定了基礎(chǔ)[12]。H5、H7亞型的陽性率均較H9亞型低，特別是2018年以來，全省H5亞型陽性率均維持在較低水平，H7亞型均未檢出，這得益于我國2017年起統(tǒng)一開展的重組AIV（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）秋季集中接種。H5亞型低水平流行可能是由于H5N1 RE-8株對應(yīng)的是2.3.4.4 b分支，而我國H5亞型的主要流行株——H5N6亞型主要對應(yīng)2.3.4.4 d分支和2.3.2.1 d分支[13]，提示應(yīng)加強(qiáng)禽類外環(huán)境市場監(jiān)測結(jié)果分析并及時(shí)更新禽流感疫苗組分。

二、不同監(jiān)測場所和不同環(huán)境樣本的AIV陽性率有差異

本研究顯示，城鄉(xiāng)活禽市場和活禽批發(fā)市場的樣本AIV陽性率均較高，分別為36.08%和35.06%。這兩類場所是禽類貿(mào)易最頻繁的場所，售賣的活禽既有本地禽類也有從其他省份或地區(qū)采購的禽類，如不嚴(yán)加管理可能會(huì)加速疫情向非疫區(qū)擴(kuò)散[14]，例如2016—2017年暴發(fā)的全國范圍內(nèi)人感染H7N9疫情[15]。逐漸復(fù)雜的活禽采購銷售渠道可能是AIV污染嚴(yán)重化的主要原因，切斷疫區(qū)和其他地區(qū)之間的活禽交易是阻止禽流感疫情的有效手段。

本研究6種不同類型的外環(huán)境樣本中，清洗禽類污水陽性率最高（45.50%），其次為案板表面樣本（35.06%），提示AIV可能通過宰殺環(huán)節(jié)污染案板，并通過污水污染周邊環(huán)境，成為人群感染禽流感的高風(fēng)險(xiǎn)因素[16]。建議將案板及清洗禽類的污水作為活禽市場常規(guī)清潔消毒的重點(diǎn)對象，同時(shí)還應(yīng)做好禽類糞便的處理和籠具、飲水器皿的清潔消毒工作。

三、保山、文山和怒江的AIV污染較嚴(yán)重

保山市、文山州和怒江州為云南省AIV核酸陽性率前3位的地區(qū)，三地均與其他國家接壤，各類家禽養(yǎng)殖和貿(mào)易活動(dòng)頻繁。同時(shí)，由于云南省內(nèi)河流、湖泊較多，部分地區(qū)濕地豐富，候鳥棲息場所分布廣泛，涉禽場所持續(xù)存在AIV污染，也增加了人類感染的風(fēng)險(xiǎn)。

從目前的形勢來看，云南省未來活禽市場的監(jiān)管措施應(yīng)日趨嚴(yán)格?；钋萁?jīng)營限制區(qū)的推廣有利于人禽流感的防控，與其他省市前期的研究結(jié)果一致[17-18]，提示云南省應(yīng)逐步擴(kuò)大活禽經(jīng)營限制區(qū)，開展家禽生鮮上市的銷售模式。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明陳瑤瑤:數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、論文撰寫；趙曉南、周潔楠、張美玲:實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、檢測結(jié)果復(fù)核；孫艷紅：數(shù)據(jù)收集整理；羅春蕊：論文撰寫、研究指導(dǎo)