何泳愉 沃恩康 楊新燕 楊燦 路鑫怡 項婷婷 馬淑敏 郭潮潭

杭州醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院與生物工程學(xué)院，杭州 310013

據(jù)統(tǒng)計，每年的季節(jié)性流感會造成29萬～65萬人死亡，對人類健康構(gòu)成重大威脅[1-2]。流感病毒基因組中的基因突變會引起抗原漂移，不僅會導(dǎo)致耐藥株的出現(xiàn)，還會逃避抗體介導(dǎo)的病毒中和，使得當(dāng)今的流感疫苗和部分抗病毒藥物無法有效地發(fā)揮作用[3]。淡豆豉始載于《名醫(yī)別錄》[4]，由黑豆/大豆、桑葉和青蒿等中藥發(fā)酵而成，常用于治療感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠等癥狀[5]。目前關(guān)于單味淡豆豉的抗流感病毒研究尚少報道，本文探討淡豆豉水煎液的體外抗流感病毒作用，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、材料與試劑

犬腎上皮細(xì)胞(MDCK)、A/Puerto Rico/8/1934(H1N1，簡稱PR8病毒)均為本實驗室保存；淡豆豉購自華東醫(yī)藥中藥飲品公司(批號190923)；β-actin抗體、HRP結(jié)合羊抗鼠抗體IgG均購自杭州華安生物科技有限公司；抗NP抗體、抗M2e抗體、抗M1a抗體均由本實驗室制備并保存；神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒、奧司他韋酸、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、BCA試劑盒、Triton X-100均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Green熒光定量試劑均購自翌圣生物科技有限公司；噻唑蘭（MTT）、二甲基亞砜(DMSO)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DMEM/High培養(yǎng)基購自Cellmax；引物序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

二、淡豆豉水煎液的制備與細(xì)胞毒性測定

1.淡豆豉水煎液的制備

稱取25 g研磨搗碎的淡豆豉顆粒，于冷水中浸泡30 min，加入500 mL純水煎煮20 min，5 000 r/min的速度離心10 min(離心半徑7 cm)去除濾渣，濾液濃縮至125 mL，使用0.22 μm濾膜過濾除菌，調(diào)配生藥濃度為200 mg/mL的淡豆豉水煎液，置于-20℃冰箱分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

2.細(xì)胞毒性實驗

用不含血清的DMEM培養(yǎng)液將淡豆豉水煎液和奧司他韋酸分別從200 mg/mL和1 mg/mL按5倍倍比稀釋成8個濃度，分別加入長成單層MDCK細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個濃度6個復(fù)孔，同時設(shè)立正常細(xì)胞組（正常細(xì)胞，只加培養(yǎng)液），空白調(diào)零組（沒有細(xì)胞，只加培養(yǎng)液）。上述4組均置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，避光作用4 h后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO搖勻10 min，使用多功能酶標(biāo)儀(BioTek)檢測490 nm的吸光度，細(xì)胞存活率=(OD藥物-OD空白)/(OD正常-OD空白)×100%。

三、淡豆豉水煎液對流感病毒生命周期抑制實驗

1.血液凝集抑制實驗

用不含血清的DMEM培養(yǎng)液將淡豆豉水煎液從200 mg/mL按2倍倍比稀釋為10個濃度(25 μL/孔)，分別與1 HAU和2 HAU的PR8病毒(25 μL/孔)于37℃混合孵育6 h，同時設(shè)置病毒對照組(25 μL PR8+25 μL PBS)，空白對照組(50 μL PBS)，每組重復(fù)3次，6 h后每孔加入50 μL 1%豚鼠紅細(xì)胞，置于4℃孵育2～4 h，觀察血凝結(jié)果。

2.淡豆豉水煎液對流感病毒生物合成抑制試驗

設(shè)立PR8+淡豆豉水煎液組[淡豆豉水煎液(8 mg/mL，1 mL)+PR8病毒(23HAU，1 mL)]和PR8組[PBS(1 mL)+PR8病毒(23HAU，1 mL)]，各組混勻置于37℃孵育4 h，混合液加入MDCK細(xì)胞中感染1 h，棄去混合液，補充無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。分別于 感 染 后 的0、4、8、12、16、20和24 h收 集 細(xì) 胞RNA，以實時熒光定量PCR檢測病毒基因M1、NP轉(zhuǎn)錄水平；于感染后的0、8、16和24 h收集細(xì)胞蛋白，以Western印跡法檢測病毒基因M1a、NP、M2e的蛋白表達(dá)；于感染后24 h固定細(xì)胞，以間接免疫熒光檢測細(xì)胞NP蛋白表達(dá)情況。所有試驗每組均重復(fù)3次。

3.淡豆豉水煎液對流感子代病毒釋放抑制試驗

將PR8+淡豆豉水煎液組和PR8組混勻置于37℃孵育4 h，混合液加入MDCK細(xì)胞中感染1 h后，棄去混合液，補充無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后收集上清進(jìn)行血凝實驗，根據(jù)細(xì)胞上清在稀釋數(shù)倍后是否引起紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象判斷子代病毒產(chǎn)生量，每組重復(fù)2次。

應(yīng)用神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒檢測淡豆豉水煎液對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用，實驗嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行，設(shè)置淡豆豉水煎液濃度(125、250、500、1 000和2 000 μg/mL)和奧司他韋酸濃度(25、50、100、200、400和500 μg/mL)，每個濃度重復(fù)3次，奧司他韋酸為陽性對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出藥物對神經(jīng)氨酸酶的抑制百分比。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Grapad Prime v8.0軟件進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，兩組之間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、淡豆豉水煎液的細(xì)胞毒性結(jié)果

如圖1所示，選取細(xì)胞生存率大于80%的濃度為細(xì)胞最大無毒濃度(TC0)，淡豆豉水煎液TC0為8 mg/mL，對照組奧司他韋酸TC0為40 μg/mL。

圖1 淡豆豉水煎液(A)和奧司他韋(B)對MDCK的細(xì)胞毒性(n=6)

二、淡豆豉水煎液阻礙流感病毒吸附結(jié)果

如圖2所示，采取兩種PR8病毒量(1 HAU、2 HAU)進(jìn)行實驗，正常情況下，病毒對照會使紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，當(dāng)使用淡豆豉水煎液與流感病毒PR8在37℃共處理6 h后,出現(xiàn)不同程度抑制血凝的作用，血凝抑制活性分別為25 mg/mL(2 HAU)、6.25 mg/mL(1 HAU)，表明淡豆豉水煎液可能存在靶點與血凝素（HA）蛋白的相互作用，從而阻斷流感病毒吸附細(xì)胞。

圖2 淡豆豉水煎液對流感病毒吸附的影響

三、淡豆豉水煎液抑制流感病毒生物合成的結(jié)果

在病毒基因轉(zhuǎn)錄層面上，與PR8組相比，PR8+淡豆豉水煎液組的流感病毒基因NP、M1的轉(zhuǎn)錄水平始終維持在低水平(t=-5.57、-9.71、-34.84、-17.85、-9.90、-8.84、-16.03、-12.33、-20.46、-28.02、-8.71、-38.11、-13.08和-16.17，P均＜0.05，見表2)。在蛋白表達(dá)水平層面上(圖3 A和表3)，與PR8組相比，PR8+淡豆豉水煎液組在第8～24小時的NP、M1a、M2e蛋白表達(dá)明顯被抑制(t=-42.53、-65.82、-39.26、-41.63、-94.42、-272.80、-41.63、-47.95和-220.00，P均＜0.05)。免疫熒光結(jié)果如圖3 B所示，與PR8組相比，PR8+淡豆豉水煎液組衡量NP蛋白表達(dá)綠色熒光明顯減少(t=-40.59，P＜0.001)，表明淡豆豉水煎液能夠抑制NP蛋白的表達(dá)，該結(jié)果與Western印跡法一致。

圖3 淡豆豉水煎液對流感病毒生物合成的影響

表2 不同時間點淡豆豉水煎液對病毒NP和M1基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響

表3 不同時間點淡豆豉水煎液對病毒NP、M1a和M2e蛋白表達(dá)水平的影響

四、淡豆豉水煎液抑制流感子代病毒釋放結(jié)果

24 h細(xì)胞上清中子代病毒的血凝效價顯示，PR8+淡豆豉水煎液組的子代病毒血凝效價為PR8組的1/8，表明淡豆豉水煎液可以抑制流感子代病毒的產(chǎn)生（圖4）。神經(jīng)氨酸酶活性抑制實驗結(jié)果表明，2 000 μg/mL的淡豆豉水煎液即能抑制大于80%的神經(jīng)氨酸酶活性，且抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，IC50=710 μg/mL。使用奧司他韋酸作為陽性對照藥物，IC50=67.7 μg/mL（表4）。以上結(jié)果提示，淡豆豉水煎液可以通過抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性，阻止新一代子病毒的有效釋放。

表4 奧司他韋和淡豆豉水煎液對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制率

圖4 淡豆豉水煎液對流感子代病毒血凝效價的影響

討 論

現(xiàn)代藥理研究表明，淡豆豉含有多種生物活性物質(zhì)包括大豆皂苷、大豆異黃酮、γ-氨基丁酸等[6]，具有降血糖、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、防治心血管疾病等作用[7-9]，而有關(guān)抗流感病毒作用的研究僅限于大豆的主要成分(如大豆異黃酮、大豆苷元)調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)[10-11]，或含淡豆豉復(fù)方制劑(如銀翹散)改善炎癥反應(yīng)和提高奧司他韋抗流感病毒效果方面[12-13]。本研究初步證實了淡豆豉有抑制流感病毒感染的功效，提示淡豆豉也許可以作為抗流感病毒候選藥，作進(jìn)一步研究開發(fā)。

一、淡豆豉水煎液可阻礙病毒吸附細(xì)胞

HA蛋白抑制劑是一類新型抗病毒藥物，可通過作用于流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的不同環(huán)節(jié)，如競爭性結(jié)合病毒HA蛋白或細(xì)胞唾液酸受體抑制病毒HA吸附宿主細(xì)胞，或抑制流感病毒包膜和內(nèi)體膜的融合過程，從而阻斷流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[14-15]。從血液凝集抑制試驗結(jié)果來看，淡豆豉水煎液可以與病毒HA相互作用，競爭性結(jié)合宿主細(xì)胞表面唾液酸受體，從而阻礙病毒吸附細(xì)胞，提示淡豆豉中含有某種化合物單體與唾液酸物類似，今后將嘗試使用分子對接技術(shù)和生物膜干涉等技術(shù)篩選出靶向HA的淡豆豉潛在單體化合物和相互作用的具體結(jié)合位點[16]。

二、淡豆豉水煎液可抑制流感病毒的生物合成

流感病毒吸附宿主細(xì)胞后脫去衣殼，病毒核糖核蛋白復(fù)合體(vRNPs)釋放至細(xì)胞質(zhì)隨后入核，在核內(nèi)啟動轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程，新產(chǎn)生的mRNA會核輸出至細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行翻譯，該過程是流感病毒生長繁殖的重要階段[17]。本實驗監(jiān)測了淡豆豉水煎液干預(yù)后流感病毒感染宿主細(xì)胞單個復(fù)制周期(24 h)的病毒基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PR8組病毒基因NP、M1轉(zhuǎn)錄水平在第4～16小時迅速增長，病毒蛋白NP、M1a、M2e在第8～24小時有大量表達(dá)，經(jīng)淡豆豉水煎液干預(yù)后，病毒基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平始終維持在低水平且未見高峰的形成，以上結(jié)果表明淡豆豉對病毒的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)均有抑制作用，但具體機制還需要進(jìn)一步探索[18-19]。

三、淡豆豉水煎液抑制神經(jīng)氨酸酶活性的安全性較好

子代病毒顆粒要經(jīng)神經(jīng)氨酸酶切斷唾液酸與HA之間的連接才能釋放至胞外并感染新的宿主細(xì)胞。從24 h細(xì)胞上清血凝結(jié)果看，淡豆豉能抑制子代病毒的產(chǎn)生，進(jìn)一步應(yīng)用神經(jīng)氨酸酶抑制實驗測定淡豆豉抑制神經(jīng)氨酸酶的能力，發(fā)現(xiàn)2 mg/mL的淡豆豉水煎液具有抑制80%神經(jīng)氨酸酶活性的能力，可以推斷淡豆豉可以通過降低神經(jīng)氨酸酶活性的能力阻斷子代病毒的釋放。淡豆豉雖然不如奧司他韋酸(奧司他韋體內(nèi)代謝物)的抑制強度，但安全性相對較好。奧司他韋是一種作用于神經(jīng)氨酸酶的特異性抑制劑，可以通過抑制子代流感病毒的釋放發(fā)揮抗流感病毒作用，目前奧司他韋在治療甲型流感病毒上仍存爭議[20-21]。因此，兼?zhèn)涞筒涣挤磻?yīng)和高抑制神經(jīng)氨酸酶活性的新型抗流感藥物有待開發(fā)。

四、結(jié)語

本研究初步發(fā)現(xiàn)淡豆豉水煎液可以通過阻礙病毒吸附，抑制病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以及減少子代病毒釋放等過程發(fā)揮體外抗流感病毒作用。由于本實驗僅為體外細(xì)胞研究,且只對流感病毒的生命周期的過程(直接作用)進(jìn)行探索，存在一定的局限性。今后將嘗試通過動物體內(nèi)實驗淡豆豉能否通過調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)作用間接發(fā)揮抗流感作用，以更準(zhǔn)確地揭示淡豆豉治療流感病毒的具體機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明何泳愉：實驗研究、采集數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析、論文撰寫及修改；沃恩康，楊新燕、楊燦、路鑫怡、項婷婷、馬淑敏：論文修改；郭潮潭：研究指導(dǎo)、論文指導(dǎo)、經(jīng)費支持