江偉藝，鄧子龍，趙望泓

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科，廣東 廣州510515

具核梭桿菌是一種革蘭氏陰性專性厭氧菌，廣泛存在于感染根管、牙周病變及其它口腔炎性病灶中［1］。近年來(lái)，因發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌在全身系統(tǒng)中異位定植，與炎癥性腸?。?］、腦膜炎［3］、心內(nèi)膜炎［4］、肝膿腫［5］、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［6］等口腔外的感染性疾病關(guān)系密切，而引起高度關(guān)注和廣泛研究。具核梭桿菌具有較強(qiáng)促炎能力，可引起黏膜屏障破壞、免疫細(xì)胞功能紊亂和機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷，引發(fā)或加重感染［7,8］。

細(xì)胞焦亡是一種具有高度促炎特性的細(xì)胞死亡方式［9］，細(xì)胞膜完整性喪失，釋放胞內(nèi)容物和促炎因子［10］，放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因此焦亡啟動(dòng)的炎癥信號(hào)和細(xì)菌引起的感染密切相關(guān)。炎癥小體不僅是識(shí)別微生物和多種危險(xiǎn)信號(hào)的感受器，而且發(fā)揮調(diào)控焦亡信號(hào)的作用［11］。因此研究炎癥小體對(duì)闡明細(xì)菌感染的機(jī)制以及控制下游的炎癥信號(hào)有重要意義。研究證實(shí)，NLRP3炎癥小體可被具核梭桿菌激活［12,13］，但NLRP1、NLRC4、AIM2等其他炎癥小體在具核梭桿菌感染中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

巨噬細(xì)胞是宿主抵抗細(xì)菌感染的第一道防線，也是具核梭桿菌感染組織中募集的主要免疫細(xì)胞［14,15］，發(fā)揮著聯(lián)系先天性免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁作用。既往研究表明，具核梭桿菌感染巨噬細(xì)胞導(dǎo)致IL-1β、TNF-α等多種細(xì)胞因子和ROS等炎癥介質(zhì)上調(diào)，與M1向極化有關(guān)［16］，但具核梭桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡和炎癥的關(guān)系不明。因此，本研究目的是探究具核梭桿菌感染對(duì)巨噬細(xì)胞焦亡的作用，篩選可能參與調(diào)控巨噬細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵分子，為具核梭桿菌感染的致病機(jī)制研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

具核梭桿菌（ATCC 25586，廣東省微生物研究所菌種保藏中心）。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7（南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供）。乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天）；RIPA 裂解液、QuickBlockTMWestern 封閉液（碧云天）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Thermo）；化學(xué)發(fā)光液（弗 徳）；一 抗：anti-caspase-1（Adipogen），anti-GSDMD（Abcam），anti-β-actin（Abcam）；GreenTB?Premix Ex TaqTM、PrimeScriptTMRT Master Mix（TaKaRa）；Lipofectamine 3000（Thermo）；Hoechst 33342/PI 雙染試劑盒（索萊寶）；si-RNA（吉?jiǎng)P）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建具核梭桿菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7模型對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的具核梭桿菌菌液在4 ℃下4000 r/min離心15 min，PBS重懸、離心，洗滌2次，將沉淀用PBS重懸，分光光度計(jì)波長(zhǎng)為600 nm吸光度調(diào)整至0.5，此時(shí)對(duì)應(yīng)的細(xì)菌濃度約為2×108CFU/mL。設(shè)置未感染組為對(duì)照，細(xì)菌感染組以不同MOI和不同時(shí)間設(shè)置梯度，將RAW264.7細(xì)胞與具核梭桿菌于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)。

1.2.2 LDH 乳酸脫氫酶試劑盒測(cè)定細(xì)胞毒性RAW264.7細(xì)胞以5×104/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為含1%血清的低血清培養(yǎng)液，設(shè)置以下分組：未經(jīng)感染的對(duì)照孔，最大酶活性對(duì)照孔，不同MOI的具核梭桿菌感染孔，以及無(wú)細(xì)胞但含有相應(yīng)MOI的細(xì)菌培養(yǎng)液孔。預(yù)定檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1 h，在最大酶活性對(duì)照孔中加入10 μL LDH釋放試劑。到達(dá)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)后，分別取各孔的上清液60 μL 與30 μL 新鮮配制的LDH 檢測(cè)工作液（10 μL 乳酸溶液+10 μL INT 溶液+10 μL酶溶液），混勻后室溫避光孵育30 min，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度A490nm。

1.2.3 Hoechst 33342/PI 熒光雙染 RAW264.7 細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于24 孔板，具核梭桿菌分別以MOI=20、100感染細(xì)胞24 h，使用預(yù)冷的且含有1%雙抗的PBS溶液漂洗細(xì)胞5 min，盡可能去除殘留的細(xì)菌；每孔分別加入配制染色工作液（染色緩沖液：Hoechst 33342：PI=200∶1∶1）300 μL，4 ℃避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照。

1.2.4 Western blot檢測(cè)caspase-1、GSDMD等焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，RIPA裂解，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，快速封閉液室溫封閉15 min，加入一抗、二抗孵育，漂洗后化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)炎癥小體的激活情況 TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，構(gòu)建反應(yīng)體系，用羅氏480 對(duì)多種炎癥小體（NLRP3、NLRC4、AIM2和NLRP1）進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量分析，以β-actin 為內(nèi)參，2-ΔΔct法計(jì)算mRNA的相對(duì)濃度。

1.2.6 轉(zhuǎn)染siRNA敲低巨噬細(xì)胞中NLRC4的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為3組：空白組、陰性對(duì)照(si-NC)組和NLRC4敲低（si-NLRC4）組。配制轉(zhuǎn)染液：溶液A（使用Opti-Medium稀釋Lipo3000）、溶液B（使用Opti-Medium稀釋siRNA，siRNA的工作濃度為100 nmol/L）；混合A、B溶液，室溫靜置15 min后加入至細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后更換新的完全培養(yǎng)基。檢測(cè)NLRC4在mRNA和蛋白水平的抑制效率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析；進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，若方差不齊，多重比較采用Dunnett's T3矯正檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 具核梭桿菌感染導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞死亡

倒置顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)特征性改變：細(xì)胞由圓形變?yōu)樗笮位蚨嘟切?，?xì)胞體積變大，細(xì)胞膜腫脹、胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，部分細(xì)胞破碎邊界不清（圖1A、B）。具核梭桿菌以20、50、100和200的MOI處理細(xì)胞24 h 后，LDH 釋放量分別為4.0%、13.2%、15.1%、15.1%（P＜0.05，圖1C）。

未感染組中PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)極少，低MOI組中有少量PI陽(yáng)性細(xì)胞，高M(jìn)OI組PI陽(yáng)性率升高（圖1D）。具核梭桿菌感染導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞膜受損，發(fā)生溶解性壞死，細(xì)菌濃度越高，發(fā)生溶解的細(xì)胞越多。

圖1 具核梭桿菌感染對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞壞死的影響Fig.1 F.nucleatum infection induces necrosis of RAW264.7 cells.A,B:Morphological changes of the cells observed under inverted microscope.C: LDH release detected by LDH assay (*P＜0.05,***P＜0.001 vs uninfected group).D:Hoechst 33342/PI double staining for detecting cell necrosis(scale bar=100 μm).

2.2 具核梭桿菌誘導(dǎo)RAW264.7焦亡并釋放炎癥因子

具核梭桿菌感染不同時(shí)間后，感染組caspase-1 p20表達(dá)在6～24 h升高，GSDMD-NT表達(dá)在12～24 h升高，且均在24 h達(dá)到頂峰；同時(shí)IL-1β釋放量在18～24 h明顯增多（圖2A）。qRT-PCR結(jié)果顯示IL-1β在mRNA水平也呈時(shí)間依賴性升高（P＜0.001，圖2B）。

不同MOI 的具核梭桿菌感染24 h 顯示，感染組GSDMD、caspase-1 表達(dá)上調(diào)；同時(shí)活化的caspase-1 p20、GSDMD-NT、IL-1β蛋白表達(dá)呈MOI依賴性升高（P＜0.001），MOI=100與MOI=200組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2C）。

圖2 具核梭桿菌感染導(dǎo)致巨噬細(xì)胞RAW264.7焦亡Fig.2 F.nucleatum triggers pyroptosis in RAW264.7 macrophages.A,B: Western blotting for detecting pyroptosis-associated proteins and qRT-PCR for detecting IL-1β mRNA expression at different time points after infection;C,D: Western blotting for detecting pyroptosis-associated proteins and qRT-PCR for detecting IL-1β mRNA expression in the infected cells at different MOIs.***P＜0.001 vs uninfected group.

2.3 不同炎癥小體在具核梭桿菌感染時(shí)的激活情況

檢測(cè)4 種最主要的炎癥小體（NLRP3、NLRC4、NLRP1和AIM-2）的表達(dá)情況，篩選可能發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的分子，結(jié)果顯示：NLRC4在6 h、12 h與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在24 h表達(dá)上調(diào)（P＜0.001），且與具核梭桿菌所致的細(xì)胞焦亡出現(xiàn)的峰值的時(shí)間點(diǎn)相一致；NLRP3 在6 h 表達(dá)上調(diào)，隨后立即下調(diào)（P＜0.001）；NLRP1在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；AIM2在6 h表達(dá)無(wú)明顯差異，隨后出現(xiàn)下調(diào)（P＜0.001，圖3）。Western blot 進(jìn)一步檢測(cè)NLRC4和NLRP3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在24 h的NLRC4較NLRP3上調(diào)更顯著（圖3 E）。

圖3 不同炎癥小體在具核梭桿菌感染時(shí)的激活情況Fig.3 Activation of NLRC4 (A),NLRP3 (B),NLRP1 (C) and AIM2 (D) inflammasomes in F.nucleatum-infected macrophages detected by qRT-PCR.***P＜0.001 vs uninfected group;E: Expressions of NLRC4 and NLRP3 detected by Western blotting.

2.4 敲低NLRC4可抑制RAW264.7細(xì)胞焦亡

qRT-PCR驗(yàn)證3條siRNA的抑制效率，si-3抑制效率最高（P＜0.001），用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，該siRNA在mRNA和蛋白水平均抑制RAW264.7細(xì)胞中NLRC4的表達(dá)，抑制率分別為80%和83%（圖4A～D）。

敲低NLRC4 后，Western blot 檢測(cè)下游信號(hào)分子caspase-1和焦亡的執(zhí)行蛋白GSDMD的活化情況，結(jié)果顯示（圖4E），未感染組中caspase-1和GSDMD沒(méi)有激活，表達(dá)量極低，在具核梭桿菌感染后，空白組和si-NC組中出現(xiàn)剪切體caspase-1 p20，同時(shí)伴隨GSDMD-NT的升高；然而si-NLRC4 組caspase-1 p20 和GSDMDNT 的升高不明顯。進(jìn)一步通過(guò)LDH 實(shí)驗(yàn)探究敲低NLRC4對(duì)RAW264.7細(xì)胞壞死的影響，結(jié)果顯示，敲低NLRC4后，具核梭桿菌感染引起細(xì)胞LDH的釋放減少（圖4F），細(xì)胞壞死情況得到一定程度的抑制。

通過(guò)檢測(cè)敲低NLRC4對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子IL-1β的影響，結(jié)果顯示未感染組IL-1β表達(dá)量低；具核梭桿菌感染后，空白組和si-NC組IL-1β升高，si-NLRC4組IL-1β的表達(dá)與未感染組比有輕微升高，但遠(yuǎn)低于空白組和si-NC組（圖4E）。

圖4 敲低NLRC4對(duì)RAW264.7細(xì)胞焦亡的影響Fig.4 Effect of NLRC4 knockdown on pyroptosis of F.nucleatum-infected RAW264.7 cells.A-C:Inhibition efficiency of NLRC4 at mRNA and protein levels.***P＜0.001 vs si-NC,Ctrl.D: Expression of NLRC4 at 48 h after siRNA transfection and at 24 h in co-culture with F.nucleatum.E: Expressions of pyroptosis-related proteins detected by Western blotting.F: LDH release assay result.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

本研究通過(guò)構(gòu)建具核梭桿菌感染巨噬細(xì)胞模型，證實(shí)具核梭桿菌激活NLRC4 炎癥小體，活化下游caspase-1/GSDMD信號(hào)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞焦亡，伴隨炎癥因子IL-1β的表達(dá)與釋放增加。同時(shí)，抑制巨噬細(xì)胞焦亡，可有效減少IL-1β的釋放，說(shuō)明具核梭桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡可能是細(xì)菌引起炎癥反應(yīng)的重要致病機(jī)制。細(xì)胞焦亡的發(fā)生依賴于炎癥小體的激活，NLRC4炎癥小體作為固有免疫的重要分子，能夠識(shí)別沙門桿菌、弗氏志賀桿菌、綠膿桿菌等多種細(xì)菌［17,18］，發(fā)揮免疫調(diào)控作用，但具核梭桿菌與NLRC4炎癥小體的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次報(bào)道巨噬細(xì)胞中的NLRC4炎癥小體能夠識(shí)別具核梭桿菌感染，并進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞焦亡。既往研究認(rèn)為NLRC4炎癥小體的激動(dòng)劑主要是細(xì)菌的鞭毛蛋白及T3SS蛋白（包括針狀蛋白分子和桿狀蛋白分子）［19,20］，但具核梭桿菌感染時(shí)NLRC4的具體活化途徑尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

NLRC4炎癥小體在細(xì)菌感染過(guò)程中具有雙重作用，一方面，取決于病原體的種類、數(shù)量，例如本研究采用的具核梭桿菌具有較強(qiáng)的促炎特性，在各種MOI感染下，均體現(xiàn)為顯著的促炎作用；而沙門氏菌感染時(shí)，NLRC4在低劑量的感染中可以抑制細(xì)菌增殖，發(fā)揮抗感染作用，僅在高強(qiáng)度感染中導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和損傷［21］。另一方面，取決于被感染的細(xì)胞類型。本研究中，NLRC4炎癥小體促進(jìn)巨噬細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致細(xì)胞壞死率和IL-1β釋放增加。其他學(xué)者針對(duì)多種免疫細(xì)胞研究，得到相似的結(jié)論，如綠膿桿菌［22］、金黃色葡萄球菌［23］以及細(xì)菌重組鞭毛蛋白可導(dǎo)致樹突細(xì)胞、中性粒細(xì)胞［23］、巨噬細(xì)胞［24］中NLRC4炎癥小體過(guò)度激活，加重全身炎癥［25,26］，這是由于免疫細(xì)胞焦亡，釋放炎癥介質(zhì)，趨化更多的炎癥細(xì)胞，造成組織的炎性損傷。然而，部分研究選取腸上皮細(xì)胞（組織）為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)NLRC4在感染中發(fā)揮保護(hù)作用，上皮細(xì)胞具有自我更新的能力，在免疫防御中主要發(fā)揮物理屏障作用，或通過(guò)分泌的抗菌物質(zhì)抑制細(xì)菌增殖，因此NLRC4炎癥小體介導(dǎo)的上皮細(xì)胞焦亡，在不損害屏障完整性的情況下，清除受損的腸上皮細(xì)胞、實(shí)現(xiàn)黏膜上皮更替、維持微生物-宿主穩(wěn)態(tài)［27,28］。在破骨細(xì)胞中，NLRC4敲除可能增加破骨細(xì)胞的活性，造成牙周炎小鼠的牙槽骨吸收更加顯著［29］。NLRC4介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡有多重作用，在具核梭桿菌感染相關(guān)疾病中的具體作用，仍需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究具核梭桿菌感染引起巨噬細(xì)胞焦亡的作用及機(jī)制，明確了NLRC4炎癥小體介導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡在具核梭桿菌感染中發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥因子的重要功能，為具核梭桿菌感染的致病機(jī)制研究提供新思路，NLRC4可能成為具核梭桿菌所致感染性疾病防治的潛在靶點(diǎn)。