李東風(fēng) ，秦子昂 ，王麗霞 ，陳芳芳 ，常 紅

（1.安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽 合肥 230091；2.安徽洪橋中科基因技術(shù)有限公司，安徽 合肥 231131；3.山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西 太原 030012）

豬呼吸道疾病在規(guī)模豬場(chǎng)多發(fā)和常見(jiàn)，往往是細(xì)菌性和病毒性疾病混合感染。目前，豬場(chǎng)對(duì)豬呼吸道病原菌的檢測(cè)步驟主要為病癥觀察，病料收集，病料培養(yǎng)基接種，抗體檢測(cè)，細(xì)菌的分離、純化、鑒定，核酸電泳等?，F(xiàn)將安徽某豬場(chǎng)出現(xiàn)呼吸道癥狀的病豬病原分離鑒定案例報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源

病料來(lái)源于安徽某發(fā)病豬場(chǎng)60日齡小豬，具有呼吸困難、高熱昏睡、肺部纖維素樣病變等呼吸道系統(tǒng)癥狀，送檢兩塊肺部組織。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基：大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰胨肉湯培養(yǎng)基（TSB）、血平板培養(yǎng)基。

生化試劑：5×TBE緩沖液、1.0%瓊脂糖凝膠、磁珠法核酸提取試劑豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑和豬圓環(huán)病毒2型通用型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑、氧化酶試紙和觸酶試劑。

抗生素藥敏紙片：頭孢噻呋、恩諾沙星、替米考星、氟苯尼考、氨芐西林、泰妙菌素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林。

1.1.3 儀器設(shè)備

超純水處理系統(tǒng)購(gòu)買(mǎi)于蘇州邦澤凈化設(shè)備有限公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)買(mǎi)于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，生物安全柜購(gòu)買(mǎi)于蘇州蘇潔醫(yī)療器械有限公司，恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)SHELLAB 公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)買(mǎi)于北京六一生物科技有限公司，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽購(gòu)買(mǎi)于北京六一生物科技有限公司，微量高速離心機(jī)購(gòu)買(mǎi)于上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，熒光PCR儀購(gòu)買(mǎi)于重慶京因生物科技有限公司，冰箱產(chǎn)自青島海爾特種電器有限公司，全自動(dòng)核酸提取儀購(gòu)買(mǎi)于賽默飛示爾科技有限公司，顯示器檢測(cè)顯微鏡購(gòu)買(mǎi)于賽默飛示爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離和純化

取不銹鋼托盤(pán)置于生物安全柜中，平鋪上一層一次性塑料袋，點(diǎn)燃酒精燈，對(duì)鑷子、接種環(huán)進(jìn)行灼燒滅菌。用鑷子從密封袋中夾出豬肺病料，輕放在托盤(pán)中，用鑷子夾起酒精棉球?qū)ωi肺的表面進(jìn)行擦拭消毒。更換酒精棉球并用酒精燈點(diǎn)燃，再次對(duì)病料表面擦拭，棄棉球于裝滿(mǎn)水的1 000 mL燒杯中滅火。用鑷子夾起豬肺組織一角輕輕提起，用無(wú)菌剪刀剪出一個(gè)截面，再?gòu)慕孛嫦騼?nèi)剪下一塊約1 cm3大小的深層組織，分別蘸于TSA平板上，用接種環(huán)進(jìn)行四區(qū)劃線(xiàn)，37℃恒溫培養(yǎng) 18～24 h。

取出恒溫箱中的培養(yǎng)基，在1號(hào)的TSA培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)有兩種形態(tài)的菌落，一種無(wú)色透明、光滑濕潤(rùn)、針尖狀，記為a菌，另一種呈半透明、表面光滑濕潤(rùn)、露珠狀的圓形菌落，記為b菌。在2號(hào)的TSA培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)有與b菌菌落形態(tài)相同的菌落，記為c菌。另取三塊TSA培養(yǎng)基，用接種環(huán)分別挑取以上三種細(xì)菌單個(gè)菌落進(jìn)行四區(qū)劃線(xiàn)，恒溫箱中37℃培養(yǎng)18 h。

將分離后得到的3種菌再次挑取單菌落接種于TSA培養(yǎng)基上進(jìn)行四區(qū)劃線(xiàn)，由于細(xì)菌純度已經(jīng)較高，每劃線(xiàn)一個(gè)區(qū)域，都需要進(jìn)行灼燒滅菌處理，最后才能得到單個(gè)菌落。恒溫箱中37℃培養(yǎng)18 h。

1.2.2 革蘭氏染色鏡檢

取兩塊載玻片，向中心滴1滴生理鹽水，用接種環(huán)分別挑取純化后的a和b菌單菌落，先點(diǎn)到中心，再陸續(xù)向外均勻涂抹于載玻片上，等待自然干燥后進(jìn)行短時(shí)間火焰固定。用革蘭氏染液進(jìn)行快速染色，置于顯微鏡下，于載玻片上滴上香柏油1滴，用1000×油鏡鏡檢。

1.2.3 氧化酶和觸酶試驗(yàn)

取3個(gè)載玻片，在中心各滴上1滴生理鹽水，用接種環(huán)依次挑取純化后的TSA平板中的3種菌的單個(gè)菌落，均勻涂布在載玻片上，再分別滴入過(guò)氧化氫試劑1-2滴，若有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，若沒(méi)有氣泡產(chǎn)生則為陰性。

取氧化酶試紙3張，用生理鹽水浸濕，用接種環(huán)分別挑取3種細(xì)菌單個(gè)菌落，在試紙上從左到右來(lái)回涂抹，若觀察到試紙?jiān)? min之內(nèi)變?yōu)樗{(lán)紫色，記為氧化酶陽(yáng)性；若試紙1 min內(nèi)沒(méi)有變色，記為氧化酶陰性。

將純化后的3種菌，用接種針?lè)謩e挑取單個(gè)菌落，接種于TSB液體培養(yǎng)基中，加入等體積的甘油封裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的藥品有：頭 孢 噻 呋（Ceftiofur）、 恩諾 沙 星（Enrofl oxacin）、 替 米考 星（Tilmicosin）、 氟 苯 尼考（Florfenicol）、 氨 芐 西 林（Ampicillin）、泰妙菌素（Tiamulin）、鏈 霉 素（Streptomycin）、 環(huán) 丙 沙星（Ciprofl oxacin）、 阿 莫 西 林（Amoxicillin）共9種。

取出保存細(xì)菌的TSA液體培養(yǎng)基，另取兩個(gè)TSA培養(yǎng)基和兩個(gè)西林瓶，瓶中加入生理鹽水至中位線(xiàn)，分別用接種環(huán)挑取a菌和b菌于西林瓶中，配制比濁度為4的菌懸液。將無(wú)菌棉簽浸潤(rùn)在菌懸液中，擠出多余的液體，在TSA培養(yǎng)基上密集、來(lái)回劃線(xiàn)，順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)培養(yǎng)基，繼續(xù)連續(xù)劃線(xiàn)，確保接種液涂抹均勻，直到培養(yǎng)基旋轉(zhuǎn)至初始位置，最后緊貼平板的內(nèi)壁涂抹兩圈。用記號(hào)筆在培養(yǎng)基底蓋上劃分出9個(gè)大小相等的區(qū)域便于放置藥敏片。

用鑷子依次夾起各藥品的藥敏片，先輕輕垂直放置于培養(yǎng)基的表面，隨后按住藥敏片一側(cè)緩緩將其平放，這樣可使鑷子不觸及培養(yǎng)基避免要反復(fù)灼燒滅菌，造成實(shí)驗(yàn)過(guò)程過(guò)長(zhǎng)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，涂菌后應(yīng)在15 min之內(nèi)貼上藥敏片。將貼好藥敏片的TSA培養(yǎng)基放入37±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，次日用游標(biāo)卡尺讀取抑菌圈大小判定耐藥性。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定

在超凈工作臺(tái)上，取1枚八聯(lián)管，將存放于TSB液體培養(yǎng)基中的a、b、c3種菌液，分別用移液器取200μL的樣品加入八聯(lián)管中，再吸取20μL的裂解液，放入離心機(jī)中離心半分鐘混合均勻后放入核酸提取儀中，啟動(dòng)程序。2 h后將提取好的核酸樣品進(jìn)行熒光PCR的體系配置。

使用磁珠法核酸提取試劑，加入反應(yīng)液 20μL，酶 1μL，4μL的核酸提取液，離心混合均勻，放入熒光PCR儀中，設(shè)定參數(shù)：95℃預(yù)熱 5 min 變性，95℃ 5 s，57℃ 15 s，72℃40 s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，72℃延伸15 min。

分別進(jìn)行豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌的熒光PCR檢測(cè)。判定標(biāo)準(zhǔn)為：有擴(kuò)增曲線(xiàn)且Ct值≤35為陽(yáng)性；35＜Ct值≤38為可疑；Ct值＞38為陰性。

之后進(jìn)行體系配置，取微型離心管1只，加入12.5 μLMix，DD水5 μL，副豬嗜血桿菌的上下游引物各1 μL，最后加入4.5 μL細(xì)菌a的核酸樣品，離心混合均勻后放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

稱(chēng)取0.75 g瓊脂糖粉末加入250 mL錐形瓶中，再向錐形瓶中加入20 mL的5×TBE緩沖液，搖勻后放入微波爐中加熱2～3 min使其完全溶解，隨后滴入溴化乙錠5 μL，搖晃均勻倒入泳道模板上自然冷卻20 min。

將配置好的瓊脂糖凝膠溶液倒入泳道模板中，定型后取出插孔，抹掉模板下方溢出的瓊脂并放入點(diǎn)泳池中，將擴(kuò)增好的a菌核酸用移液器吸取5 μL加入到第5個(gè)孔中，在第2個(gè)孔中加入5 μL陰性對(duì)照，在第3個(gè)孔中加入5 μL陽(yáng)性對(duì)照，在第1個(gè) 孔 中 加 入 2000 BPMark5 μL，接通電泳儀的電源以100～120 v電壓進(jìn)行核酸電泳45 min。電泳完成后，倒出模板上的瓊脂，放入凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行紫外照射得到電泳圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料接種

肺組織接種的TSA平板區(qū)域生長(zhǎng)有3種形態(tài)的菌落。一種無(wú)色透明、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、針尖狀菌落，另外兩種菌落形態(tài)特征相似，其一呈半透明、表面光滑濕潤(rùn)、露珠狀的圓形菌落；其二呈半透明、表面光滑濕潤(rùn)、露珠狀的圓形菌落。結(jié)果如圖1。

圖1 病料TSA培養(yǎng)基接種圖

2.2 革蘭氏染色鏡檢

經(jīng)過(guò)革蘭氏染色后，置于油鏡下觀察：a菌呈革蘭氏陰性短小絲狀桿菌，兩頭鈍圓；b菌呈革蘭氏陽(yáng)性球菌，單個(gè)或多個(gè)鏈狀排列；c菌呈呈革蘭氏陽(yáng)性球菌，單個(gè)或多個(gè)鏈狀排列。故a疑似副豬嗜血桿菌，b和c疑似為豬鏈球菌。染色結(jié)果如圖2和圖3。

圖2 a菌革蘭氏染色鏡檢圖（1000×）

圖3 b菌和c菌革蘭氏染色鏡檢圖（1000×）

2.3 溶血試驗(yàn)和衛(wèi)星試驗(yàn)

取兩塊血平板接種環(huán)分別挑取b菌和c菌單菌落進(jìn)行四區(qū)劃線(xiàn)接種，恒溫箱中37±1℃培養(yǎng)18～24 h得到純化后的細(xì)菌。其中在TSA上的3種菌菌落形態(tài)與初步分離時(shí)相同，在血平板上的細(xì)菌呈細(xì)小圓形、邊緣整齊并有溶血環(huán)現(xiàn)象，試驗(yàn)結(jié)果如圖4，符合鏈球菌的菌落特征。

圖4 b菌和c菌血平板劃線(xiàn)培養(yǎng)圖

另取血平板1塊，挑取純化后的a菌單個(gè)菌落，在血平板上橫向平行劃線(xiàn)，灼燒接種環(huán)，再?gòu)慕瘘S色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株平板上挑取金黃色葡萄球菌，在血平板左右各三分之一處垂直于a菌的線(xiàn)劃線(xiàn)，恒溫箱中37℃培養(yǎng)18 h，進(jìn)行衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5，a菌大多數(shù)集中于金黃色葡萄球菌的周?chē)L(zhǎng)，分布密集，遠(yuǎn)離金黃色球菌的地方菌落稀疏。

圖5 衛(wèi)星試驗(yàn)結(jié)果圖

2.4 氧化酶和觸酶試驗(yàn)結(jié)果

觸酶試驗(yàn)觀察到a有產(chǎn)生大量氣泡的現(xiàn)象，記為觸酶陽(yáng)性。b和c沒(méi)有氣泡產(chǎn)生記為觸酶陰性。氧化酶試驗(yàn)觀察到a菌的試紙?jiān)? min之內(nèi)變?yōu)樗{(lán)紫色，記為氧化酶陽(yáng)性。b和c菌的試紙沒(méi)有變色，記為氧化酶陰性。

以上細(xì)菌鑒定結(jié)果如表1所示。

表1 細(xì)菌鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表

2.5 病原菌生物學(xué)鑒定結(jié)果

根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，a菌疑似副豬嗜血桿菌；b菌和c菌疑似豬鏈球菌，依此為進(jìn)一步試驗(yàn)的基礎(chǔ)結(jié)論。

2.6 熒光PCR鑒定

2.6.1 豬鏈球菌PCR擴(kuò)增

豬鏈球菌PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示，陽(yáng)性對(duì)照Ct值處于正常范圍內(nèi)，且b菌和c菌Ct值均小于陽(yáng)性對(duì)照，故判定病料存在豬鏈球菌感染。

圖6 豬鏈球菌PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

2.6.2 副豬嗜血桿菌PCR擴(kuò)增

副豬嗜血桿菌PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖7所示，陽(yáng)性對(duì)照Ct值處于正常范圍內(nèi)，且a菌Ct值＜35，故判定病料存在副豬嗜血桿菌感染。

圖7 副豬嗜血桿菌PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

2.6.3 豬圓環(huán)病毒2型PCR擴(kuò)增

豬圓環(huán)病毒2型PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖8所示，陽(yáng)性對(duì)照Ct值處于正常范圍內(nèi)，35＜樣品Ct值≤ 38，故結(jié)果判定為可疑，該豬可能存在豬圓環(huán)病毒2型感染。

圖8 豬圓環(huán)病毒2型PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

2.6.4 豬繁殖與呼吸綜合征病毒PCR擴(kuò)增

豬繁殖與呼吸綜合征病毒PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖9所示，樣品無(wú)Ct值，判定為該豬沒(méi)有豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。

圖9 豬繁殖與呼吸綜合征病毒PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

2.7 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

由圖10電泳圖譜可知，樣品的bp值位于750 bp和1 000 bp之間，位置與陽(yáng)性對(duì)照相同，bp值為822 bp，故a菌為副豬嗜血桿菌。

圖10 副豬嗜血桿菌瓊脂糖凝膠電泳圖

2.8 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。副豬嗜血桿菌對(duì)頭孢噻呋、恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林敏感性極高，對(duì)替米考星、泰妙菌素中度敏感，對(duì)氨芐西林、鏈霉素、環(huán)丙沙星耐藥。豬鏈球菌對(duì)頭孢噻呋、恩諾沙星敏感性極高，對(duì)氨芐西林、泰妙菌素、阿莫西林中度敏感，對(duì)替米考星、氟苯尼考、鏈霉素、環(huán)丙沙星耐藥。

表2 副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷表

3 討論

本實(shí)驗(yàn)成功從樣品肺組織中分離出副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌，并檢測(cè)出病料組織存在豬圓環(huán)病毒2型感染，不存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。對(duì)于豬呼吸道病原的鑒定，首先應(yīng)當(dāng)根據(jù)臨床癥狀以及發(fā)病前的管理程序結(jié)合當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)史初步確定可能的病原體，再取病豬臨床癥狀明顯的組織或器官如肺、喉頭接種于營(yíng)養(yǎng)成分豐富的培養(yǎng)基如TSA，確保苛養(yǎng)菌能夠正常生長(zhǎng)。對(duì)培養(yǎng)出來(lái)的菌落觀察其形態(tài)特征，通過(guò)革蘭氏染色鏡檢進(jìn)一步篩選出符合條件的細(xì)菌并做出假設(shè)。隨后進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)，初步驗(yàn)證假設(shè)后進(jìn)行熒光PCR鑒定和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

該鑒定過(guò)程中時(shí)刻需要注意無(wú)菌操作，所有器材使用前必須經(jīng)高壓滅菌，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須全程在超凈工作臺(tái)和生物安全柜中進(jìn)行。細(xì)菌的初步分離純化是鑒定過(guò)程中最關(guān)鍵的步驟，必須純化出單個(gè)菌落才能進(jìn)行之后的實(shí)驗(yàn)操作，因此操作者應(yīng)熟練四區(qū)劃線(xiàn)手法，一區(qū)劃線(xiàn)后需要對(duì)接種環(huán)進(jìn)行灼燒后才能繼續(xù)劃線(xiàn)，否則很難生長(zhǎng)出單個(gè)菌落。

此方法能夠在48 h內(nèi)迅速確定病原體，操作簡(jiǎn)潔，步驟嚴(yán)謹(jǐn)、符合邏輯，且鑒定所需儀器試劑和設(shè)備中小型豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)均可設(shè)立。普通PCR需要人工進(jìn)行核酸提取，需要多次添加試劑進(jìn)行離心，操作復(fù)雜且樣品易受污染。而本實(shí)驗(yàn)采取的熒光PCR只需使用商業(yè)化的PCR檢測(cè)試劑盒，加入模板和引物后放入熒光PCR儀中，選擇設(shè)定好的程序即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，且通常反應(yīng)在1～3 h內(nèi)，通過(guò)反應(yīng)的Ct值即可判斷感染情況。