蘭可心 ，張學煒 ，鄭璐璐 ，王 敏 ，崔茂盛

（1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300380；2.天津市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

哺乳動物卵巢內(nèi)含有大量的原始卵泡，是當前科研上獲取卵母細胞的重要原材料。隨著轉(zhuǎn)基因、克隆等胚胎工程技術日漸成熟，對卵母細胞的需求也在不斷增加。體內(nèi)成熟技術（in vitro maturation，IVM）和超數(shù)排卵技術所獲得的卵母細胞數(shù)量有限，實際操作復雜且成本高。而屠宰場所提供的卵巢數(shù)量大、所獲得卵母細胞充足且成本低廉。各研究所現(xiàn)在更趨向于選擇屠宰場的廢棄卵巢用來作為體外成熟卵母細胞的原材料。但因屠宰場和實驗室之間距離以及工作時間因素的影響，卵巢從離體到實驗對其進行處理使用的時間是不定的。導致采集卵母細胞的時間不可控，有時需要較長的時間。因此，為了合理安排實驗的同時節(jié)省運輸費用，需要對離體卵巢進行一定時間的保存。目前已有對常見家畜（豬、牛、綿羊、山羊等）以及一些特種動物（家貓、犬、野生梅花鹿、伊比利亞紅鹿、羊駝、兔、鼠、牦牛、驢等）的相關報道。將卵巢從動物死亡那一刻起直至到實驗人員取卵母細胞為止的保存條件是維持卵母細胞活力的重要因素，不適當?shù)谋４鏃l件會對后續(xù)實驗造成不利影響，可見如何在卵巢保存的過程中維持組織內(nèi)卵泡的活力對于后續(xù)的研究工作是十分重要的。

1 卵巢運輸及保存溫度

當離體卵巢所處的環(huán)境發(fā)生變化時，會對卵泡及卵母細胞造成負面影響。溫血動物體內(nèi)存在的酶在正常體溫的溫度時活性最強，細胞的新陳代謝與酶的活性有關，而酶的活性與溫度呈現(xiàn)依賴性。細胞代謝會消耗細胞內(nèi)能量，緊接著消耗保存介質(zhì)中的營養(yǎng)和氧氣。所以，即使在很短的保存時間（例如2 h或4 h）內(nèi)，也可能會啟動顆粒細胞以及卵母細胞凋亡導致較高的濾泡閉鎖率。據(jù)相關研究報道，在卵泡內(nèi)的卵母細胞因為受到了卵泡內(nèi)環(huán)境的保護避免了溫度變化對其的損傷，相較于生發(fā)泡階段分離的卵母細胞對于冷刺激的表現(xiàn)較弱。對于短時間內(nèi)（3～4 h）保存山羊、蒙古牛、綿羊、牦牛、奶牛卵巢的研究結(jié)果顯示，在接近于室溫時（20～25℃），更有利于保持卵巢細胞的活性。王鋒等研究發(fā)現(xiàn)，牛卵巢保存在接近牛正常體溫的溶液內(nèi)2～4 h可以維持正常代謝，對卵巢保存更有利。造成結(jié)果存在差異性的原因可能與所取卵巢母牛的品種、年齡、飼養(yǎng)環(huán)境等有關。對于豬卵巢，豬卵母細胞對冷卻非常敏感，當溫度冷卻到16℃以下時，會失去細胞膜的完整性。25～35℃是保持豬卵母細胞質(zhì)量、減數(shù)分裂能力和體外受精率的最佳溫度條件。石金月等報道，將兔卵巢保存在25-30℃ 0.9%NaCl（含雙抗）中，4 h內(nèi)送回實驗室，更有利于卵母細胞的成熟培養(yǎng)。這可能與不同物種間卵巢對于溫度敏感度不同有關。在較低溫度下保存的卵巢的卵裂率和囊胚率明顯低于其他處理，可能是因為在收集卵母細胞前，長期暴露在低溫下的卵巢對胚胎發(fā)育能力有負面影響。當采用較高溫度保存時，卵母細胞會因受到熱應激從而影響成熟質(zhì)量。會使卵母細胞成熟加快，使卵泡中產(chǎn)生的有害物質(zhì)不斷集聚，對細胞產(chǎn)生負影響。將卵巢保存在較低的溫度下時，細胞代謝率隨之也降低，使其可以用最小限度的代謝來抵抗因為缺少營養(yǎng)和氧氣所導致的能量減少。在低溫環(huán)境下保存卵巢，對酸中毒以及細胞凋亡過程會有所緩解。

2 卵巢運輸及保存時間

據(jù)相關研究表明，從屠宰場收集的卵巢到采集卵母細胞的時間與卵母細胞的質(zhì)量呈正比。但實際上會受到各種因素影響。1）運輸時間。根據(jù)當?shù)叵嚓P法規(guī)要求，屠宰場大多位于遠離城市的郊區(qū)，導致屠宰場與實驗室有一定的距離的情況存在。在一些國家因為研究物種的特殊性，也會跨地區(qū)運輸。2）工作時間。屠宰場的工作時間會根據(jù)當?shù)胤ㄒ?guī)規(guī)定而不同，有些地區(qū)屠宰工作需要在下午或者晚間進行。當卵巢運到實驗室時，有時會與實驗室工作人員的工作時間發(fā)生沖突。3）卵巢數(shù)量。因研究物種不同，對于一些特種動物的研究，當需要獲得足夠的實驗材料時需要在多個不同的屠宰點進行采集。受以上因素影響，需要對卵巢進行一定時間的保存。Anna Rita Piras等報道，家貓卵巢保存在4℃時，當儲存長達24 h時，只會引起少量的腔前卵泡和卵母細胞的改變。但當貯存時間超過24 h，隨著貯存時間延長會導致卵泡結(jié)構(gòu)逐漸受損，影響體外成熟卵母細胞的氧化狀態(tài)和體外受精后的發(fā)育能力。庫爾班·吐拉克對野生梅花鹿保存卵巢實驗報道，細胞成熟率以及卵子變形率會隨著時間的延長而不斷增加。Pimprapar、Matías Nicolás Tellado等報道，將豬卵巢保存在35℃，隨著貯存時間的延長，卵泡液的pH、葡萄糖濃度、生發(fā)泡期未成熟卵母細胞的存活率、氧化活性和成熟率均呈下降趨勢，細胞核DNA片段化的卵母細胞比例增加。Alicia Martín-Maestro等報道，綿羊卵巢保存時間為5 h時是對維持綿羊卵母細胞質(zhì)量和發(fā)育能力的最適宜。顆粒細胞在貯存時大于7 h會活力降低導致氧化還原狀態(tài)和線粒體活性受損，失去對卵母細胞的支撐和保護作用。隨著保存時間的延長，由于離體卵巢缺乏氧氣以及營養(yǎng)的供應導致毒素累積，在不同物種中對卵巢中卵母細胞的質(zhì)量會造成不同程度的影響。這可能是因為長期暴露在低溫下將不可避免地導致離子濃度失衡、代謝停滯和溫度依賴性膜功能失衡。

3 卵巢運輸及保存介質(zhì)

保存溶液的組成成分是影響卵巢保存效果的重要因素之一。而找到對卵巢毒性及損傷最小的保存溶液的最佳成分至關重要。但確定保存溶液中缺少的有效成分是很難的。同時，對于保存溶液的選擇不僅要兼顧成本和可用性，也要考慮卵巢到達實驗室所需要的時間。對于這種情況，許多研究評估了不同溶液對卵巢運輸過程中保存效果及卵泡健康狀態(tài)的影響。生理鹽水和磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline,PBS）價格低廉且使用率較高。0.9%生理鹽水具有成本低且已有商品化產(chǎn)品的優(yōu)點，使用便捷。雖然僅由水和氯化鈉組成，已經(jīng)是大多數(shù)實驗室低溫（4℃）運輸卵巢的主要選擇。

研究人員嘗試使用不同溶液對保存效果進行改善。發(fā)現(xiàn)使用Braun-Collins溶液、椰子水、最低基本培養(yǎng)基（Minimum Essential Medium，MEM）和組織培養(yǎng)基199（Medium199，M199）等營養(yǎng)物質(zhì)更豐富的保存溶液來保存卵巢能更好地保證卵母細胞的活性。Braun-Collins溶液是高滲溶液，當其用于卵巢組織運輸時，不僅可以促進細胞脫水，同時可以避免細胞腫脹。而椰子水富含豐富的氨基酸、能量、維生素以及礦物質(zhì)等。在反芻動物牛和山羊的卵巢組織保存運輸后，可以有效地保持卵泡的良好形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。椰子水中的生長素3-吲哚乙酸（IAA）添加到M199中時，有益于山羊腔前卵泡的保存。可能是因為IAA與卵巢組織中的生長因子相加作用，同時加強了生長因子在卵母細胞中的作用，維持細胞通透性及呼吸模式。

為了防止卵母細胞受到氧化應激進而導致DNA損傷，也可以添加其他促進細胞生長或抗氧化類添加劑，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒、谷氨酰胺、次黃嘌呤和牛血清白蛋白等。商業(yè)培養(yǎng)基成本高昂，現(xiàn)階段已有研究人員推薦是用價格更合理的藥用植物提取物作為保存介質(zhì)。龍涎草和桑樹乙醇提取物對于保存山羊和綿羊卵巢組織已有相關研究，研究表明，將羊卵巢于4℃保存6 h，與對照組的正常腔前卵泡的百分比和凋亡率相比其正常腔前卵泡的百分比和凋亡率無顯著差異。天然植物提取物中含有天然抗氧化劑，可減少不同細胞類型中的氧化應激和DNA損傷。

4 其他因素

有研究表明，將卵巢組織切割為3 mm×3 mm×1 mm的組織塊，更有利于培養(yǎng)基滲透進組織。相較來說，運輸整個卵巢或較大塊的卵巢組織，因為操作簡便所需時間更少，其可行性更高。而且，在收集過程中操作越繁瑣越容易導致組織污染。同時，隨著組織塊的大小變化，會對剩余組織內(nèi)的營養(yǎng)成分以及氧氣消耗相對加快，進而影響體外保存卵巢皮質(zhì)的卵泡代謝速率。在評估整個卵巢、一半卵巢或較小器官碎片對卵泡存活效果的研究中，結(jié)果也不盡相同，而導致結(jié)果差異的原因可能與研究物種或保存溶液成分相關。卵巢保存受到多因素影響。包括器官或組織碎片大小、溫度和可用性大小。也有研究提供了將溫度保存在接近生理體溫的保存方式，如水浴、便攜式培養(yǎng)箱或卵母細胞轉(zhuǎn)運箱。不同物種的卵巢所處的生殖周期階段以及生殖道部分是否存在等因素也會影響卵巢運輸質(zhì)量以及進一步的卵母細胞質(zhì)量。在犬類中，保存在4℃的卵巢中獲得的卵母細胞的成熟率最高，最低的試驗組是37℃。此外，不同運輸溫度對從黃體或卵泡期卵巢收集的卵母細胞的成熟率沒有顯著影響。重要的是，仍需要進一步研究以評估不同因素（發(fā)情周期階段、身體狀況、年齡等）對卵巢組織運輸?shù)挠绊?。通過簡單有效的保存程序，已經(jīng)做出了許多努力來優(yōu)化運輸條件。

5 總結(jié)

卵巢離體后環(huán)境改變?nèi)狈ρ鯕庖约盃I養(yǎng)的供應，導致毒素累積，對卵泡內(nèi)的卵母細胞造成了負面影響。卵巢的保存條件會引起卵泡的代謝變化從而改變卵泡液的PH，卵泡液PH隨著溫度的提高不斷下降。葡萄糖是卵泡內(nèi)卵母細胞成熟過程中關鍵的能量來源，隨著時間延長，卵泡液內(nèi)的葡萄糖不斷被消耗，含量減少。缺氧也會引起代謝途徑的改變，由有氧代謝轉(zhuǎn)變到無氧糖酵解，其產(chǎn)物主要是乳酸。以上因素使乳酸在細胞內(nèi)濃度不斷升高，卵泡液逐漸偏向酸性環(huán)境造成酸中毒，從而影響卵母細胞的后續(xù)發(fā)育潛能。卵母細胞會隨著生存環(huán)境不同而選擇不同的死亡途徑。缺血條件下的酸中毒、復氧和再灌注的作用強烈刺激細胞進行程序性細胞死亡。缺氧導致ROS生成，引起氧化應激，使卵巢內(nèi)卵泡發(fā)生自噬、凋亡、壞死等多種細胞死亡途徑以及退行性變化。當保存時間超過24 h時，氧化應激（OS）是阻礙卵母細胞體外成熟（IVM）的因素之一。隨著時間的延長，卵母細胞周圍顆粒細胞的死亡導致營養(yǎng)供應的中斷，導致ROS的產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^卵母細胞活性氧水平、相關凋亡指標和基因表達來評估卵母細胞的質(zhì)量。

6 結(jié)論

考慮到卵母細胞的質(zhì)量決定了受精后胚胎的發(fā)育潛力，從動物死亡的那一刻起直到卵巢被加工完成，卵母細胞的完整性是至關重要的。當保存時間小于6 h時，保存溫度接近于室溫（20～25℃）是比較好的選擇。當保存時間大于12 h，低溫保存更有利于卵巢保存。有研究表明，在體內(nèi)和體外培養(yǎng)條件下，采用酶和非酶氧化劑，可以降低ROS水平，抑制caspase活性，可通過內(nèi)源性凋亡途徑調(diào)節(jié)細胞凋亡程度，改善卵巢活性以及卵母細胞質(zhì)量。當卵巢經(jīng)過保存后在體外培養(yǎng)液內(nèi)添加能量物質(zhì)（葡萄糖）、抗氧化劑（白藜蘆醇）等可以對卵母細胞的發(fā)育潛能形成正面影響。需要強調(diào)的是，物種和卵泡種類（腔前或腔內(nèi)）對貯藏溫度的反應是不同的。腔前卵泡因環(huán)境變化，發(fā)生氧化應激、代謝途徑變化、毒素積累等都會誘導細胞凋亡。針對目前各實驗室研究物種、時間間隔、溫度變化不同，以及體外培養(yǎng)條件差異等因素影響，導致各實驗室研究結(jié)果并不統(tǒng)一。加強對于長距離運輸卵巢的研究可以拓展遠距離卵巢資源的應用。目前大多數(shù)研究僅對成熟率和極體率進行了對比，缺少對卵母細胞分子水平的研究，所以有必要在細胞和分子水平闡明發(fā)生在卵母細胞內(nèi)的時間，以便采取適當?shù)拇胧﹣頊p少這種損害，有助于人為調(diào)節(jié)或干預卵泡發(fā)育。