林心君，胡海霞，何昱霖，秦崇濤 ，施 紅*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122）

糖尿病已成為全球廣泛關(guān)注的公共健康問題，截至2019 年，全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)4.63 億，據(jù)估算，到2045 年糖尿病患病率將上升至12.2%，其中2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）約占所有糖尿病病例的90%［1］。糖尿病是以高血糖為主要特征的代謝性疾病，與中醫(yī)“消渴”“脾癉”等病證相類［2］。本課題組經(jīng)過多年臨床-基礎(chǔ)的反復(fù)實踐，探索形成的中藥復(fù)方石斛合劑（石斛合劑1 號方和石斛合劑2 號方）已獲國家發(fā)明專利（專利號：ZL201110408411.0），是福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑（批準(zhǔn)文號：閩藥制字Z 20120006）。課題組前期研究顯示：石斛合劑能明顯緩解糖尿病患者口干、乏力、燥熱等癥狀，具有穩(wěn)定的降糖調(diào)脂、改善肝功能等作用，還能改善糖尿病模型大鼠的糖脂代謝，促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖和胰島素受體表達(dá)，抑制肝臟和腎臟纖維化［3-6］。糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，并發(fā)癥更是累及機(jī)體多器官、多系統(tǒng)，用相對和絕對定量同位素標(biāo)記（iTRAQ）技術(shù)篩選糖尿病差異蛋白已成為糖尿病診療研究的新熱點(diǎn)之一［7］。故課題組應(yīng)用石斛合劑治療糖尿病大鼠，提取大鼠肝組織蛋白，以iTRAQ 技術(shù)鑒定并分析各組大鼠的差異蛋白質(zhì)，繼而進(jìn)行代謝通路富集分析，探討石斛合劑對糖尿病大鼠糖脂代謝相關(guān)通路的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級 Wistar 大鼠 40 只，體質(zhì)量（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，單籠5 只飼養(yǎng)，自由取食和飲水，12 h 光照/12 h 黑暗，室溫 25 ℃，相對濕度60%～70%?；A(chǔ)飼料由動物實驗中心提供，高脂飼料配方為60.7%基礎(chǔ)飼料、15%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、4%膽固醇和0.3%膽酸鹽。

1.2 實驗藥物 石斛合劑1 號方（黃芪20 g，石斛15 g，知母10 g，葛根 15 g，五味子 8 g，生地黃 15 g，丹參15 g，黃連6 g，地龍9 g）、石斛合劑 2 號方（茵陳18 g，滑石 15 g，扁蓄15 g，梔子10 g，車前子10 g，大黃3 g）購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，用水分別浸泡上述 2 方藥材 30 min，然后采用水提醇沉法［5］制備成含生藥量2 g/mL 的藥液，將藥液按每瓶100 mL分裝，密封保存在-20 ℃冰箱，待用時水浴加熱。二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，產(chǎn)品批號：1302094）用蒸餾水稀釋至含藥量5 g/L，每瓶100 mL 分裝。

1.3 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司，貨號：WXBB2432）；質(zhì)譜級胰蛋白酶Trypsin（美國 Thermo Scientific 公司，貨號：90057）；iTRAQ試劑（美國SCIEX 公司，貨號：4381664）；Triple TOF 5600 質(zhì)譜儀器（美國SCIEX 公司，型號：AB SCIEX，Concord，ON）；納升液相色譜儀（日本島津公司，型號：LC-20AD）。

2 實驗方法

2.1 造模、干預(yù)和取材 40 只Wistar 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)抽取10 只大鼠作為正常組，予普通飼料喂養(yǎng)；剩余30 只為造模組，予高脂高糖飼料喂養(yǎng) 6 周后，腹腔注射 STZ（每次 25 mg/kg，連續(xù) 2 次，時間間隔3 d）加以誘導(dǎo)［8］。第2 次腹腔注射STZ 72 h 后尾靜脈采血，用快速血糖儀檢測血糖，以隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L 判定造模成功（本研究中造模組大鼠全部成模）。造模組按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、石斛合劑組、二甲雙胍組，每組10 只。石斛合劑組先以石斛合劑 1 號方按 8.6 mL/（kg·d）灌胃7 d，繼以石斛合劑2 號方按6.2 mL/（kg·d）灌胃3 d，如此循環(huán)灌胃60 d；二甲雙胍組以二甲雙胍溶液10 mL/（kg·d）灌胃，藥物劑量均按 60 kg 成人臨床等效劑量進(jìn)行干預(yù)；模型組、正常組按10 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，連續(xù)60 d。

2.2 血糖血脂檢測 灌胃結(jié)束，禁食12 h，腹腔注射10%烏拉坦麻醉，迅速開腹，抽取各組大鼠腹主動脈血，采用全自動生化儀分析空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）。斷頭處死大鼠后每組隨機(jī)取3 只大鼠肝組織置于液氮中儲存以行蛋白組學(xué)檢測。

2.3 肝組織差異蛋白質(zhì)代謝通路富集分析 ①從肝組織提取蛋白，對提取后的蛋白進(jìn)行還原烷基化處理，打開二硫鍵以便后續(xù)步驟充分酶解蛋白。② 取出上述蛋白100 μg，按蛋白∶酶＝20∶1 加入胰蛋白酶Trypsin 酶解。③Bradford 法計算出蛋白濃度。④按照iTRAQ 試劑盒說明書，采用iTRAQ 技術(shù)標(biāo)記每一組肽段，室溫培養(yǎng)2 h；將標(biāo)記后的肽段進(jìn)行等量混合，混合后的肽段使用強(qiáng)陽離子交換色譜進(jìn)行預(yù)分離；最后進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析［9］。⑤ 選擇數(shù)據(jù)庫 IPI（International Protein Index）Rat（39925 sequences）［10］，用蛋白質(zhì)鑒定軟件Mascot 2.3.02（檢索參數(shù)設(shè)置見表1）搜索數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的肽段及蛋白質(zhì)鑒定；比較各蛋白在不同組間的相對含量，當(dāng)?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達(dá)到1.2 倍以上，且P＜0.05 時視為差異蛋白；通過富集分析確定差異蛋白質(zhì)參與的主要代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

表1 檢索參數(shù)設(shè)置

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料屬正態(tài)分布以（）表示，組間比較采用單因素方差分析（LSD 或Games-Howell）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 4 組大鼠FBG、TC、TG 水平比較 見表2。

表2 4 組大鼠 FBG、TC、TG 水平比較（） mmol/L

表2 4 組大鼠 FBG、TC、TG 水平比較（） mmol/L

注：與正常組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05；與模型組比較，3）P＜0.01，4）P＜0.05。

TG 0.64±0.10 0.91±0.282）0.69±0.114）0.82±0.08組別正常組模型組石斛合劑組二甲雙胍組n 10 10 10 10 FBG 5.43±0.46 16.89±1.291）6.99±1.073）6.38±0.913）TC 1.75±0.09 2.05±0.212）1.82±0.104）1.75±0.114）

3.2 肝組織差異蛋白代謝通路富集分析結(jié)果 肝組織蛋白共鑒定出iTRAQ 標(biāo)記的肽段所代表的蛋白3 631 個，其中石斛合劑組/模型組的肝組織差異蛋白為352 種［9］；按差異蛋白在信號通路中的貢獻(xiàn)度（即該差異蛋白占該信號通路總蛋白數(shù)的百分比）從高到低排序，石斛合劑組/模型組肝組織差異蛋白代謝通路富集分析結(jié)果見表3。

表3 石斛合劑組/模型組的肝組織差異蛋白代謝通路富集分析（n，%）

4 討 論

4.1 石斛合劑對糖尿病模型大鼠糖脂代謝的影響 本研究采用高糖高脂飼料加STZ 注射誘發(fā)的動物模型，接近人類T2DM 的發(fā)病過程［8］。本實驗結(jié)果顯示：模型組大鼠FBG 顯著高于正常組，且在實驗期間FBG 均＞11.1 mmol/L，說明模型穩(wěn)定性好；治療后石斛合劑組、二甲雙胍組FBG 均明顯降低，說明石斛合劑有確切的降血糖作用；與正常組比較，模型組TC、TG 有顯著上升，說明模型大鼠存在脂代謝紊亂，高脂血癥是產(chǎn)生胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、炎癥反應(yīng)等代謝障礙的關(guān)鍵因素［11-12］；石斛合劑治療后TC、TG 相較模型組下降顯著，說明石斛合劑能糾正糖尿病模型大鼠血脂代謝紊亂；二甲雙胍組TC 也有顯著下降，而TG 雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上，石斛合劑能改善糖尿病大鼠的糖脂代謝，減少糖脂毒性的損傷，這與課題組前期研究結(jié)果一致。

4.2 肝組織差異蛋白代謝通路分析 在肝臟糖異生與糖酵解共同作用，使機(jī)體葡萄糖維持在一定的濃度，若糖異生過度可引起機(jī)體血糖升高。IR 已成為 T2DM 的主要病理標(biāo)志［13-14］，而炎癥與 IR 關(guān)系密切，近年來炎癥學(xué)說在T2DM 發(fā)病機(jī)制的研究中備受關(guān)注。作為核轉(zhuǎn)錄因子之一的核因子κB（NF-κB）可被高血糖激活，通過多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞和組織炎癥，不僅干擾胰島素分泌，還能通過抑制胰島素信號通路中的關(guān)鍵因子導(dǎo)致IR 的發(fā)生［15］。本研究結(jié)果顯示石斛合劑組/模型組的肝組織差異蛋白涉及糖異生/糖酵解通路、胰島素信號通路、NF-κB通路，故石斛合劑可能通過上述多條信號通路改善糖尿病大鼠的糖脂代謝。

生糖氨基酸可通過糖異生轉(zhuǎn)化成葡萄糖，其代謝異常會導(dǎo)致機(jī)體糖異生異常［16］。研究發(fā)現(xiàn)在亮氨酸缺乏條件下，肝臟胰島素的靈敏度增高［17］；而當(dāng)異亮氨酸和纈氨酸缺乏時，小鼠出現(xiàn)脂肪組織產(chǎn)熱以及分解增加，而出現(xiàn)消瘦［18］。提示亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸信號通路障礙可導(dǎo)致糖異生失常［19］。此外精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸代謝異常等均可誘發(fā)或加重糖尿病，其中甘氨酸的降低與游離脂肪酸（FFA）的增加有關(guān)，并與T2DM 的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，色氨酸在糖尿病患者的血漿中升高，與T2DM 發(fā)病率呈顯著的正相關(guān)［20-21］。本研究結(jié)果顯示石斛合劑可能通過上述氨基酸信號通路調(diào)節(jié)糖異生，改善糖脂代謝。

糖尿病脂毒性學(xué)說認(rèn)為：異常的脂代謝可造成胰島素敏感組織（肝臟、脂肪和骨骼?。┲挟惓５闹练e并導(dǎo)致IR。脂肪細(xì)胞分泌的多種炎癥因子可引起β 細(xì)胞凋亡和 IR，誘發(fā)或加重T2DM［22］。有研究表明飽和脂肪酸與DM 患病風(fēng)險呈正相關(guān)［23］。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）包括α、β、γ 3 種表型，其中PPARα 是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的重要因子，而PPARγ 除了能調(diào)節(jié)脂代謝，還有抗肝纖維化的作用［24］。本研究結(jié)果顯示石斛合劑可能通過脂肪酸代謝通路和PPAR 通路調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的脂代謝。

糖代謝產(chǎn)生的碳骨架、蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨基酸以及甘油都可進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA）氧化，因此TCA 是糖類、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的共同通路。這三大物質(zhì)都可轉(zhuǎn)化成丙酮酸，并通過中間產(chǎn)物乙酰輔酶A 進(jìn)入三羧酸循環(huán)，釋放出大量的ATP 為機(jī)體各項生理過程供能。與能量代謝有關(guān)的檸檬酸是TCA 的起始步驟，檸檬酸信號通路傳導(dǎo)異常直接導(dǎo)致TCA 出現(xiàn)異常。氧化磷酸化是合成ATP 的主要途徑，該信號通路傳導(dǎo)異常則誘發(fā)線粒體損傷及細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示石斛合劑可能通過淀粉與蔗糖的代謝、檸檬酸代謝、丙酮酸代謝和氧化磷酸化通路調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的糖脂代謝。

本研究中差異蛋白所涉及的多條信號通路都與糖尿病糖脂代謝紊亂相關(guān)，這為石斛合劑防治糖尿病及其并發(fā)癥的研究提供了新的思路和方法。