周臨 羅榮#

（1江西省醫(yī)療器械檢測中心 南昌 330029；2江西省藥物研究所 南昌 330029）

奧美拉唑（Omeprazole）化學(xué)名稱是5-甲氧基-2-{［（4甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基）-甲基］-亞磺酰基}-1H-苯并咪唑，為苯并咪唑類質(zhì)子泵抑制劑，是一種有效的抗消化性潰瘍藥，用于治療十二指腸潰瘍、胃潰瘍、反流性食管炎等，具有療效高、耐受性好、復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點(diǎn)[1]。圖1為奧美拉唑常見合成工藝流程圖[2]。

圖1 奧美拉唑常見合成工藝流程圖

為了保證藥物的質(zhì)量和臨床用藥安全有效，對藥物中的雜質(zhì)進(jìn)行檢查很有必要?！稓W洲藥典》EP[3]和《英國藥典》BP[4]分別采用不加校正因子的主成分自身對照法和TLC法檢測奧美拉唑中的雜質(zhì)，而《美國藥典》USP[5]采用加校正因子的主成分自身對照法檢測奧美拉唑中的雜質(zhì)，2020年版《中國藥典》二部[6]采用不加校正因子的主成分自身對照法檢測奧美拉唑中的雜質(zhì)。為了更加準(zhǔn)確的檢測奧美拉唑制劑中雜質(zhì)的含量，本研究建立了加校正因子的主成分自身對照法同時檢測奧美拉唑腸溶膠囊中幾種特殊雜質(zhì)（雜質(zhì)A～E）的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津10A系列高效液相色譜儀（CLASS-VP色譜工作站）；Me5型電子分析天平（賽多利斯公司）；Waters Purifier實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)。

1.2 試劑 磷酸氫二鈉和磷酸為分析純，甲醇和乙睛為色譜純，水為超純水。

1.3 試藥 雜質(zhì)（A）：奧美拉唑硫醚-N-氧化物（Omeprazole Sulphane-N-Oxide）含量99.25%；雜質(zhì)（B）：奧 美 拉 唑 砜-N-氧 化 物（Omeprazole Sulphone-N-Oxide）含量99.50%；雜質(zhì)（C）：奧美拉唑-N-氧化物（Omeprazole-N-Oxide）含量99.60%；雜質(zhì)（D）：奧美拉唑硫醚（Ufiprazole or Omeprazole Sulphane）含量99.50%；雜質(zhì)（E）：奧美拉唑砜（Omeprazole Sulphone）含量99.93%。雜質(zhì)對照品均由本單位自制，相關(guān)結(jié)構(gòu)式見圖2，原料奧美拉唑（山東壽光藥業(yè)有限責(zé)任公司，含量99.90%），中間體苯并咪唑和氯化物。奧美拉唑腸溶膠囊（9個廠家共16個批號）。

圖2 奧美拉唑各雜質(zhì)名稱及結(jié)構(gòu)式

2 色譜方法

2.1 對照品溶液和供試品溶液、自身對照溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 稱取各雜質(zhì)對照品（雜質(zhì)A 10.08 mg，雜質(zhì)B 10.10 mg，雜質(zhì)C 10.02 mg，雜質(zhì)D 10.05 mg，雜質(zhì)E 10.13 mg，苯并咪唑10.21 mg，氯化物10.10 mg），置于25 ml容量瓶中，用流動相適量超聲溶解并稀釋至刻度，作為溶液a，精密量取溶液a 1.0 ml，置于100 ml容量瓶中，用流動相稀釋成各含0.004 mg/ml的溶液，作為雜質(zhì)對照品溶液，用于有關(guān)物質(zhì)定量。稱取奧美拉唑?qū)φ掌?0.12 mg，量取溶液a 250μl，置于25 ml容量瓶中，用流動相適量超聲溶解，稀釋制成含奧美拉唑0.40 mg/ml和各雜質(zhì)0.004 mg/ml的溶液，作為混合對照品溶液，用于雜質(zhì)色譜峰定位。

2.1.2 供試品溶液制備 稱取奧美拉唑腸溶膠囊內(nèi)容物0.20 g，置于10 ml容量瓶中，加流動相適量超聲溶解，濾過，取續(xù)濾液，用流動相稀釋制成含奧美拉唑約0.40 mg/ml的溶液，即得。

2.1.3 自身對照溶液制備 精密量取供試品溶液1.0 ml，置于100 ml容量瓶中，加入流動相稀釋成含奧美拉唑0.004 mg/ml（1%）的溶液，作為自身對照溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C8柱（150 mm×4.6 mm），Boston Crest C8柱（150 mm×4.6 mm）。流動相為乙腈：0.01 M磷酸氫二鈉（磷酸調(diào)節(jié)pH至7.6）（25：75），流速為1.0 ml/min，檢測波長為280 nm，柱溫為30℃。國內(nèi)外藥典中奧美拉唑的有關(guān)物質(zhì)及其色譜條件見表1。

表1 國內(nèi)外藥典中奧美拉唑的有關(guān)物質(zhì)及其色譜條件

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 吸取混合對照品溶液注入液相色譜儀，查看色譜圖，奧美拉唑峰的保留時間約為13 min，奧美拉唑峰與各雜質(zhì)峰的分離度均符合規(guī)定（＞1.0）。見圖3。

圖3 混合對照品色譜圖

3 高效液相色譜（HPLC）方法的確定

3.1 色譜柱的選擇 試驗(yàn)中我們分別選擇了C8色譜柱系統(tǒng)（Phenomenex Luna C8柱，150 mm×4.6 mm）和C18色譜柱系統(tǒng)（安捷倫C18柱，150 mm×4.6 mm），結(jié)果在C8色譜柱系統(tǒng)和C18色譜柱系統(tǒng)下奧美拉唑峰與各雜質(zhì)峰之間分離度均良好。

3.2 色譜條件的選擇 參照中國藥典2020年版二部奧美拉唑項(xiàng)下有關(guān)物質(zhì)檢查法，以及借鑒相關(guān)文獻(xiàn)資料[7～14]，最終確定以乙腈：0.01 M磷酸氫二鈉（磷酸調(diào)節(jié)pH至7.6）（25：75）為流動相，在該色譜條件下，各雜質(zhì)峰與主峰之間均能達(dá)到良好分離。

3.3 檢測波長的選擇 國外藥典以及《中國藥典》2020年版二部中奧美拉唑的有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下，檢查波長大部分為280 nm，取奧美拉唑及各雜質(zhì)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果也均在280 nm左右有最大吸收波長，因此本研究確定在280 nm處測定各雜質(zhì)的含量。

原來如此……袁安的母親在妓院里聽到的，李離的父親由酒席上聽到的，那些不可思議的故事，那些流光溢彩的傳奇，都來自一個在深山里信口開河的老瞎子，就像柳毅遇到洞庭龍王，魏征砍掉涇河龍王的腦袋，這樣半真半假的傳奇，茶余飯后是很好的消遣，可是你選擇了相信它，并因此跋山涉水夢寐求之……袁安抬頭盯著李離看，李離將手捂在雙眼上，四個少年，一時間覺得之前吞到胃里的黃粱酒，比黃連膽汁來得都要苦。

3.4 色譜圖保留時間的確定 通過試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)在主峰的出峰時間3倍以后基本沒有出現(xiàn)雜質(zhì)峰，因此確定色譜圖的保留時間為主峰出峰時間的3倍。

3.5 專屬性破壞試驗(yàn) 通過幾種破壞試驗(yàn)的結(jié)果能夠看出，奧美拉唑在高溫破壞和光照破壞的條件下相對比較穩(wěn)定，產(chǎn)生的雜質(zhì)較少；而在酸破壞（0.1 M鹽酸溶液）、堿破壞（0.1 M氫氧化鈉溶液）和氧化破壞（30%雙氧水溶液）的條件下容易降解產(chǎn)生較多雜質(zhì)。

3.5.1 酸破壞試驗(yàn) 取本品約0.2 g，置于50 ml量瓶中，加甲醇20 ml，超聲使其溶解，加0.1 M鹽酸10 ml，放置1 h，再水浴加熱5 min，加0.1 M氫氧化鈉10 ml中和，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取1～10 ml于棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，取續(xù)濾液作為酸破壞樣品溶液，進(jìn)樣。見圖4。

圖4 奧美拉唑酸破壞色譜圖

3.5.2 堿破壞試驗(yàn) 取本品約0.2 g，置于50 ml量瓶中，加甲醇20 ml，超聲使其溶解，加0.1 M氫氧化鈉10 ml，放置1 h，再水浴加熱5 min，加0.1 M鹽酸10 ml中和，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取1～10 ml于棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，取續(xù)濾液作為堿破壞樣品溶液，進(jìn)樣。見圖5。

圖5 奧美拉唑堿破壞色譜圖

3.5.3 氧化破壞試驗(yàn) 取本品約0.2 g，置于50 ml量瓶中，加甲醇20 ml，超聲使其溶解，加30%雙氧水5 ml，放置30 min，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取1～10 ml于棕色量瓶中，加甲醇至刻度，取續(xù)濾液作為氧化破壞樣品溶液，進(jìn)樣。見圖6。

圖6 奧美拉唑氧化破壞色譜圖

3.5.4 高溫破壞試驗(yàn) 取本品適量，在120℃高溫下放置2 h，稱取適量，加甲醇制成0.4 mg/ml的溶液，取續(xù)濾液作為高溫破壞樣品溶液，進(jìn)樣。見圖7。

圖7 奧美拉唑高溫破壞色譜圖

3.5.5 光照破壞試驗(yàn) 取本品適量，在LX4500光照強(qiáng)度下放置約7×24 h，稱取適量，加甲醇制成0.4 mg/ml的溶液，取續(xù)濾液作為光照破壞樣品溶液，進(jìn)樣。見圖8。

圖8 奧美拉唑光照破壞色譜圖

3.7 檢測限和定量限 在280 nm下，奧美拉唑檢測限為1 ng（0.1μg/ml），定量限為4 ng（0.4μg/ml）；雜質(zhì)C檢測限為1 ng（0.1μg/ml），定量限為4 ng（0.4μg/ml）。

3.8 供試品溶液的穩(wěn)定性 將供試品溶液在室溫環(huán)境分別放置0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h后，分別進(jìn)樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品溶液在2 h內(nèi)雜質(zhì)含量變化不大，隨著放置時間的延長，最大單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)的含量均有升高，表明供試品溶液不夠穩(wěn)定，樣品測試時應(yīng)臨用新配。

3.9 線性范圍

3.9.1 奧美拉唑線性范圍 精密稱取奧美拉唑?qū)φ掌罚?0.07 mg）置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別精密吸取0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.2 ml、1.6 ml、2.0 ml至25.0 ml于棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。分別精密吸取適量注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，奧美拉唑進(jìn)樣濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明奧美拉唑在0.403～8.056μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為：Y=17376X-880，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

3.9.2 雜質(zhì)C線性范圍 精密稱取雜質(zhì)C對照品（10.16 mg）置于100 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.2 ml、1.6 ml、2.0 ml至25.0 ml于棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。分別精密吸取適量注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，雜質(zhì)C進(jìn)樣濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明雜質(zhì)C在0.406～8.128μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為：Y=23703X-901，相關(guān)系數(shù)r=1.000 0。

3.1 0重復(fù)性 取同一批次的樣品，分別稱取6份平行樣，按2.1.2方法制備作為供試品溶液，依法測定，計(jì)算得重復(fù)性結(jié)果為雜質(zhì)A含量0.14%，RSD為0.28%；雜質(zhì)C含量0.14%，RSD為0.33%；其他雜質(zhì)含量0.19%，RSD為0.27%。結(jié)果表明本試驗(yàn)的重復(fù)性良好。

3.1 1加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一批次已知有關(guān)物質(zhì)含量的樣品，分別稱取9份平行樣，置于10 ml量瓶中，分別加入高、中、低濃度的雜質(zhì)C對照品，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，依法測定，計(jì)算得高、中、低三個濃度的回收率分別為96.22%、93.49%、92.87%，平均回收率為94.19%，RSD為2.19%。結(jié)果表明方法的準(zhǔn)確度良好。

3.1 2耐用性 采用色譜柱Agilent XDB-C18，4.6 mm×150 mm；Waters C18，3.9 mm×150 mm；Phenomenex Luna-C8，4.6 mm×150 mm分別進(jìn)行試驗(yàn)，測定同一批次樣品的有關(guān)物質(zhì)含量，測定結(jié)果基本一致，本試驗(yàn)表明本方法耐用性良好。

3.1 3各已知雜質(zhì)的相對保留時間和校正因子 以奧美拉唑的保留時間為1，計(jì)算各雜質(zhì)的相對保留時間和校正因子，校正因子（f）=As×Cr/Ar×Cs（As為雜質(zhì)對照品的峰面積，Cr為待測成分對照品的濃度，Ar為待測成分對照品的峰面積，Cs為雜質(zhì)對照品待測成分的濃度）。見表2。

表2 各已知雜質(zhì)的相對保留時間和校正因子

4 結(jié)果

對總共9個廠家16批制劑采用以上方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上制劑中均檢出了奧美拉唑的雜質(zhì)A，而奧美拉唑的中間產(chǎn)物氯化物和雜質(zhì)B均未檢出。而通過不加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算所得出的雜質(zhì)含量結(jié)果與加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算所得出的雜質(zhì)含量結(jié)果相比較可以看出，由于不同的雜質(zhì)檢測方法其最大檢測波長不一樣，雜質(zhì)的峰面積不經(jīng)過校正因子校正所計(jì)算出的結(jié)果不夠準(zhǔn)確，定量測定容易產(chǎn)生誤差。見表3、表4。

表3 不加校正因子的主成分自身對照法結(jié)果（%）

表4 加校正因子的主成分自身對照法結(jié)果（%）

5 討論

奧美拉唑的化學(xué)性質(zhì)較不穩(wěn)定，遇酸、熱和氧化劑、光照等均容易發(fā)生變質(zhì)降解，尤其是對pH值比較敏感，特別是在酸性條件時奧美拉唑的化學(xué)結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化，出現(xiàn)聚合和變色現(xiàn)象，因此建立一個合適的方法來檢測奧美拉唑及其制劑的有關(guān)物質(zhì)非常重要。目前我國大部分化學(xué)藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，檢查有關(guān)物質(zhì)的方法主要有不加校正因子的主成分自身對照法、加校正因子的主成分自身對照法、面積歸一化法和雜質(zhì)對照品法。這四種有關(guān)物質(zhì)的檢測方法中，不加校正因子的主成分自身對照法由于不同的雜質(zhì)檢測的最大響應(yīng)波長不一樣，雜質(zhì)峰面積不經(jīng)校正因子校正所計(jì)算出的結(jié)果不夠準(zhǔn)確，定量測定容易產(chǎn)生誤差；面積歸一化法測定的誤差較大，一般不用于藥品中微量雜質(zhì)的檢查；而雜質(zhì)對照品法雖然能夠準(zhǔn)確測定藥品中的雜質(zhì)含量，可需要長期提供對照品，而且雜質(zhì)對照品價格較貴，有時候還不一定能夠買到；加校正因子的主成分自身對照法不需要長期提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而且可以把不同的標(biāo)準(zhǔn)雜質(zhì)對照品的濃度值轉(zhuǎn)化為固定的常數(shù)值，因此成為現(xiàn)階段有關(guān)物質(zhì)測定比較理想的手段[15]。

本試驗(yàn)建立的加校正因子的主成分自身對照法可以同時檢測奧美拉唑腸溶制劑中5種特殊雜質(zhì)的含量，消除了雜質(zhì)與主成分響應(yīng)因子不同所引起的測定誤差，而且不必長期提供雜質(zhì)對照品。結(jié)果表明，該方法可以準(zhǔn)確測定奧美拉唑腸溶膠囊中有關(guān)物質(zhì)的含量。