陳成 項蕭楠 劉治坤 王建國 徐驍

(1 浙江大學醫(yī)學院附屬湖州醫(yī)院肝膽胰外科，浙江 湖州 313000；2 浙江大學醫(yī)學院;3 浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科;4 浙江省腫瘤融合研究與智能醫(yī)學重點實驗室;5 浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院肝膽胰外科)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)具有高發(fā)病率、高死亡率的特點，5年總體生存率不足20%[1]。手術切除是HCC的主要治療手段[2]，但術后5年復發(fā)率高達70%，嚴重影響患者預后生存。準確預測HCC術后患者預后并及時早期干預，可以有效延長HCC患者的生存時間。微血管侵犯(MVI)是HCC主要轉移方式之一[3-4]，是HCC患者術后復發(fā)的重要危險因素，常常與預后不良相關[5-6]。研究發(fā)現FAM123B可通過Akt信號通路誘導上皮-間質轉化，從而促進HCC轉移[7]。另有研究顯示CR1和NFκB/p65可形成促進HCC侵襲的正反饋環(huán)[8]，這些因子也許可以作為預測切除術后HCC復發(fā)的生物標志物，但目前仍缺乏具有較高靈敏度和特異度的MVI分子標志物的報道，因此探索新型HCC的MVI標志物，對其術后復發(fā)的預警具有重要意義。蛋白質組學分析借助于串聯質譜標記及同位素標記相對和絕對定量技術，目前已廣泛用于新的腫瘤生物標志物研究探索之中[9-10]。本研究通過蛋白質組學技術分析MVI相關的蛋白標志物，探討基于蛋白質組學的HCC復發(fā)預警模型對HCC患者預后預測的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 HCC患者腫瘤組織樣本的收集和蛋白質組學分析

收集浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院術后病理確診為HCC患者的腫瘤組織樣本6例，其中MVI陽性患者3例，MVI陰性患者3例，MVI的診斷依據術后病理報告結果。樣本的蛋白質組學檢測和分析委托北京博奧生物科技有限公司進行，按照串聯質譜標簽試劑盒(90064,Thermo公司，美國)的說明進行樣品制備和標記。采用液相色譜串聯質譜技術分析獲得腫瘤組織中蛋白的平均表達水平，將P<0.05及Log2差異倍數>1.20或<0.83蛋白質定義為MVI陽性與陰性腫瘤組織的顯著差異表達蛋白。

1.2 顯著差異表達蛋白與HCC患者預后相關性的分析

HCC患者臨床信息和腫瘤組織與癌旁組織的mRNA表達譜數據通過TCGA數據庫(https://cbioportal.org/)[11]下載，隨后使用GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)[12]分析顯著差異表達蛋白在基因表達水平與HCC患者生存預后的相關性。

1.3 HCC組織芯片制作

收集浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院2015年1月—2018年10月病理確診為HCC患者的腫瘤組織及其癌旁正常組織樣本200例，委托上海芯超生物科技有限公司制作組織芯片并命名為TMA-1，同時收集這200例HCC患者的生存信息。

1.4 顯著差異表達蛋白的免疫反應評分測定及其與HCC患者預后的相關性分析

采用免疫組織化學方法檢測顯著差異表達蛋白在TMA-1中的表達情況，按照免疫組織化學染色試劑盒的操作要求對TMA-1進行染色。將4 μm組織芯片TMA-1徹底脫蠟，并在適當的緩沖液中進行熱抗原修復。然后在室溫下采用0.5%過氧化氫孵育20 min以阻斷內源性過氧化物酶。用正常山羊血清在37 ℃下阻斷40 min，然后與適當稀釋的一抗在4 ℃下孵育18 h。抗體孵育后，用TBST緩沖液沖洗3次(每次5 min)。然后，用HRP偶聯二抗(購買自中國ZSGB-Bio公司)在37 ℃下孵育30 min。TBST徹底清洗后，對載玻片進行DAB染色和蘇木精重新染色。用相同稀釋倍數的鼠或兔IgG替代一抗獲得陰性對照切片。

通過半定量方法對腫瘤細胞進行免疫反應評分(IRS)[13]。IRS為細胞染色強度(0～3分)與陽性百分比(0～4分)的乘積[14]。IRS大于6分被定義為蛋白高表達，采用電話隨訪獲取200例HCC患者預后信息，采用Kaplan-Meier方法分析顯著差異表達蛋白與HCC患者預后相關性。

1.5 復發(fā)預警列線圖模型構建及臨床驗證

對TMA-1中200例HCC患者的臨床病理特征基線和顯著差異表達蛋白進行單因素Cox回歸分析，對單因素分析中P<0.05的因素進行多因素COX回歸分析，獲得HCC患者術后復發(fā)的獨立危險因素。采用所有獨立危險因素構建復發(fā)預警列線圖，并根據列線圖計算風險評分，以風險評分中位數為截斷值將患者分為高風險組和低風險組，比較兩組的生存預后情況。采用自助抽樣驗證方法對復發(fā)預警模型進行臨床驗證。

1.6 統計分析

應用R軟件(版本3.6.3)和SPSS 21.0軟件進行分析。采用Kaplan-Meier進行生存分析。采用COX比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析。采用一致性指數(C-index)評價列線圖的預測能力，校準曲線評價列線圖的預測符合度，采用受試者工作特征(ROC)曲線評價列線圖模型的預后預測效能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HCC患者腫瘤組織樣本的蛋白質組學分析

蛋白質組學分析結果顯示，與MVI陰性腫瘤組織對比，MVI陽性腫瘤組織中顯著上調蛋白16個，顯著下調蛋白23個。

2.2 顯著差異表達蛋白與HCC患者預后的相關性分析

通過TCGA數據庫下載HCC患者數據，采用GEPIA數據庫分析上述39個顯著差異表達蛋白在HCC組織與癌旁組織中基因表達水平的差異，并進一步分析這些顯著差異表達蛋白的基因表達水平與HCC患者預后相關性。結果顯示在HCC組織中共7個蛋白表達基因(U2SURP、RFC4、NUTF2、BCAP31、CRELD2、EEF1E1和GBA2)顯著上調，3個蛋白表達基因(ADH4、HRG、FABP1)顯著下調。進一步生存分析的結果顯示，HCC組織之中ADH4和HRG高表達的患者的總生存率(OS)顯著高于低表達的患者(P<0.05)，而HCC組織中U2SURP、RFC4以及NUTF2高表達的患者OS顯著低于低表達的患者(P<0.05)，上述5個顯著差異性表達蛋白的基因表達水平與患者的預后具有密切相關。

2.3 顯著差異表達蛋白的IRS及其與HCC患者預后的相關性分析

采用免疫組織化學方法在TMA-1中對上述5個顯著差異表達蛋白進行染色，結果顯示(表1)，U2SURP、RFC4和NUTF2在腫瘤組織中表達顯著高于癌旁組織(t=7.17～15.18，P<0.001)，而ADH4的表達顯著低于癌旁組織(t=-19.18，P<0.001)。HRG在腫瘤組織和癌旁組織中陽性百分比較低，分別為5%和4%，故后續(xù)沒有對其進行進一步分析。

采用Kaplan-Meier方法對上述4個顯著差異表達蛋白與HCC患者預后進行相關性分析。結果顯示，腫瘤組織中ADH4高表達患者的OS和無復發(fā)生存率(RFS)顯著高于ADH4低表達患者，腫瘤組織中U2SURP低表達患者的OS和RFS顯著高于U2SURP高表達患者(P<0.05)。而NUTF2和RFC4的表達與患者預后無顯著相關性(P>0.05)。

表1 顯著差異表達蛋白的IRSTab.1 IRS of significantly differentially expressed proteins

2.4 復發(fā)預警列線圖模型構建及臨床驗證

對TMA-1中200例HCC患者的臨床病理特征基線指標和顯著差異表達蛋白進行單因素COX回歸分析，結果表明腫瘤直徑≥5 cm(HR=2.214，95%CI=1.342～3.653)，年齡>50歲(HR=1.095，95%CI=1.016～1.227)，AFP≥20 μg/L(HR=2.347，95%CI=1.575～3.499)，MVI陽性(HR=2.044，95%CI=1.434～2.916)，腫瘤分化程度為中-低分化(HR=1.709，95%CI=1.200～2.433)，U2SURP高表達(HR=1.880，95%CI=1.307～2.706)以及ADH4低表達(HR=2.225，95%CI=1.442～3.442)是HCC術后復發(fā)的危險因素(P<0.05)，性別和腫瘤數目對HCC術后的復發(fā)無顯著影響(P>0.05)。將上述因素納入多因素COX回歸分析并用森林圖展示，結果顯示U2SURP高表達、ADH4低表達、腫瘤直徑≥5 cm和AFP≥20 μg/L是HCC患者術后復發(fā)的獨立危險因素(P<0.05)，詳見圖1A。以這4個參數構建列線圖模型并在HCC患者(n=200)中驗證(圖1B)，結果顯示，HCC患者RFS預測值一致性指數(C-index)為0.71(95%CI=0.67～0.76)，見圖2A、B。高風險組和低風險組的預后生存分析結果顯示，低風險組的RFS和OS顯著高于高風險組(P<0.05)(圖2C和D)。ROC曲線顯示，列線圖預測HCC患者術后1、3年RFS的曲線下面積(AUC)分別為0.75(95%CI=0.68～0.81)和0.76(95%CI=0.69～0.83)，見圖3。上述結果顯示該復發(fā)預警列線圖模型可以預測HCC復發(fā)情況。

A：風險比森林圖，B：HCC復發(fā)預警列線圖圖1 HCC復發(fā)預警列線圖Fig.1 Recurrence warning nomogram of hepatocellular carcinoma

A、B分別為HCC患者1年和3年RFS預測的校準曲線，C、D分別為HCC患者RFS和OS的Kaplan-Meier分析圖2 HCC患者的Kaplan-Meier分析Fig.2 Kaplan-Meier analysis of hepatocellular carcinoma

圖3 HCC患者的ROC分析Fig.3 ROC analysis of hepatocellular carcinoma

3 討 論

HCC是原發(fā)性肝癌中最常見的一種病理類型，約占原發(fā)性肝癌的75%～85%[15]。由于HCC早期診斷困難且術后復發(fā)率高，患者的預后生存情況普遍不理想[16]。以往研究表明，HCC患者的MVI陽性與預后不良顯著相關[17]，但是目前尚無理想的MVI分子標志物可應用于臨床實踐。蛋白質組學研究可比較不同細胞、組織間蛋白質表達的異同，有助于探索疾病診斷標志物和治療靶點，具有重要應用價值。

本研究運用蛋白質組學技術揭示了MVI陽性的HCC中差異表達的蛋白分子標志物，共篩選出16個上調的差異表達蛋白和23個下調的差異表達蛋白。初步采用TCGA數據庫去驗證上述39個差異表達蛋白的基因表達水平，發(fā)現其中有10個差異表達蛋白在基因水平存在顯著差異，其中ADH4、U2SURP等5個差異表達蛋白與患者生存預后顯著相關，并進一步進行了免疫組織化學驗證和預后生存分析。

ADH4是ADH家族成員，可作為多種底物的代謝酶。ADH4在卵巢癌、喉癌、食管癌等惡性腫瘤中異常表達，并且參與了大部分癌癥相關生理過程[18-19]。有研究報道，與正常肝臟相比，HCC組織中ADH4的表達顯著下調[20-22]，提示ADH4和乙醇代謝失調可能參與了HCC的發(fā)生，HCC組織中ADH4低表達與患者較低的OS相關，ADH4表達水平可以作為患者OS的獨立預測因子[20]。然而，HCC中ADH4與MVI的相關性尚無研究報道。本研究結果顯示，ADH4低表達與MVI陽性顯著相關，并且ADH4高表達HCC患者OS和RFS顯著高于低表達患者。

研究示U2SURP是U2 snRNP相關蛋白[23]，其與RBM17以及CHERP相互作用，調節(jié)彼此的穩(wěn)定性，并調控下游RNA結合蛋白[24]。在癌癥研究領域，U2SURP參與了結腸癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，并對患者的預后有重要影響[25]。然而，尚無研究報道U2SURP與HCC之間關系。本研究發(fā)現U2SURP高表達與MVI陽性相關，且U2SURP低表達HCC患者OS和RFS顯著高于高表達患者，提示U2SURP可能是HCC術后復發(fā)預警的分子標志物。

本研究進一步建立了包含U2SURP、ADH4、腫瘤直徑以及AFP值4個參數的列線圖模型，并在HCC肝切除隊列中進行驗證，結果顯示低風險組患者的RFS和OS顯著高于高風險組患者。近年來，關于HCC患者的預后相關特征和生存風險模型已有相關研究報道。如，有研究通過多組學分析建立了一個8基因模型(ACADS、HSD17B13、PON3、AMDHD1、CYP2C8、CYP4A11、SLC27A5以及CYP2E1)來預測HCC患者的預后情況，該模型之中基因的高表達與較低的HCC分期/風險評分相關[26]。LI等[27]亦建立了基于年齡、性別、分期和6個基因特征等4個獨立因素的列線圖模型來預測HCC術后患者的OS。上述研究可能有助于臨床醫(yī)生對HCC術后患者的個體化治療方案進行選擇。然而，這些預測預后的模型在很大程度上都是依賴于從公共數據庫中檢索得到的數據，這些模型是否能夠應用于臨床尚無定論。因此，本研究所建立的預后模型可能成為HCC術后患者OS和RFS預測的可靠工具，或有助于臨床醫(yī)生篩選HCC術后高危復發(fā)患者并選擇合理的個性化治療方案。

本研究中也存在著一定的局限性：①ADH4和U2SURP兩個蛋白標志物在HCC的MVI中的具體機制尚需進一步探究；②本研究構建的復發(fā)預警列線圖模型采用了內部驗證，后續(xù)需收集多中心大樣本的數據進一步進行驗證。

綜上，本研究建立的模型整合了MVI相關的蛋白標志物(ADH4和U2SURP)、腫瘤直徑和AFP值，經HCC肝切除隊列驗證后具有良好的預后預測效果，對HCC術后患者的復發(fā)預警和早期干預可能具有重要的參考價值。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：陳成、王建國、徐驍參與了研究設計；陳成、項蕭楠、劉治坤、王建國、徐驍參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byCHENCheng,WANGJianguo, andXUXiao. The manuscript was drafted and revised byCHENCheng,XIANGXiaonan,LIUZhikun,WANGJianguo, andXUXiao. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.