趙舒玨，吳杭菲，鄭靖宇，章瓊瑩，申屠楊萍，黃卡特，李劍敏

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325035

糖尿病是一種廣泛影響人類(lèi)健康的慢性病，根據(jù)WHO報(bào)道，糖尿病患者數(shù)量急劇增加[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy, DR）是長(zhǎng)期的高血糖導(dǎo)致的最常見(jiàn)的糖尿病微血管病變。其病理發(fā)展過(guò)程分兩個(gè)階段：非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變（non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR）和增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy, PDR）。在NPDR期出現(xiàn)微血管瘤，在PDR期則出現(xiàn)新生血管形成，最終導(dǎo)致患者視力下降，乃至失明[2]。有研究顯示，機(jī)體內(nèi)多種因素均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的表達(dá)增加，VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管通透性增加、細(xì)胞移行、微小血管球和新血管形成等生物學(xué)效應(yīng)在DR的發(fā)展過(guò)程中起重要的作用[3]。Micro-RNAs（miRNA）是真核生物中長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA[4]。大量研究表明miRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化、代謝和死亡等一系列生物學(xué)過(guò)程[5-6]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1,Sirt1）是去乙?；讣易宄蓡T之一，位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[7]。通過(guò)搜索miRNA基因庫(kù)（www.micrororna.org）發(fā)現(xiàn)Sirt1 mRNA的3’-UTR與miRNA-195片段相匹配，Sirt1可能是miRNA-195的靶點(diǎn)。前期在糖尿病心肌病的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)miRNA-195表達(dá)增高，負(fù)向調(diào)節(jié)Sirt1表達(dá)，證明Sirt1是miRNA-195的作用靶點(diǎn)[8]。SHAN等[9]在DR的研究中發(fā)現(xiàn)高糖（high glucose, HG）環(huán)境中視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞miRNA-195表達(dá)明顯增高，并通過(guò)抑制Sirt1的表達(dá)促進(jìn)DR的進(jìn)展。HG環(huán)境中miRNA-195 inhibitor是否可抑制HUVECs中VEGF的表達(dá)，從而減少侵襲、遷移和新血管形成，目前鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用HG孵育人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVECs）ECV304，用miRNA-195 mimic、miRNA-195 inhibitor或Sirt1激活劑的白藜蘆醇（resveratrol, RES）處理HG環(huán)境下的細(xì)胞，觀察miRNA-195和Sirt1/FoxO1/Caveolin-1/VEGF的變化，同時(shí)觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔形成。以期探討miRNA-195 inhibitor對(duì)HG環(huán)境下HUVECs的生物學(xué)行為的變化及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 HUVECs購(gòu)自ATCC，試劑盒CCK-8購(gòu)自日本同仁公司，低糖DMEM、高糖DMEM、d-葡萄糖購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司，胎牛血清、胰酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，Lipo2000、TRIzol、Sirt1和GAPDH的PCR引物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Prime Script?RT試劑盒均購(gòu)自日本TaKara公司。miRNA-195 PCR引物由廣州瑞博生物有限公司提供，RIPA、PMSF、AP、SDS、ECL購(gòu)自上海碧云天生物有限公司，Sirt1、FoxO1、Caveolin-1、VEGF、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。Matrige matrix、RES購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 主要試劑配制

1.2.1 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液：按照比例，在高糖DMEM和低糖DMEM培養(yǎng)基中，加入青鏈霉雙抗試劑及血清，配成含10%胎牛血清及1%雙抗的高、低糖培養(yǎng)基，4 ℃保存。

1.2.2 細(xì)胞凍存液：按照70%細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液、20%FBS、10% DMSO的比例將凍存液配制于離心管中。

1.2.3 miRNA-195轉(zhuǎn)染試劑：①miRNA-195 mimic：從-20 ℃冰箱取出離心解凍，加50 μL H2O于miScript miRNA mimic，得終濃度為20 μmol/L的mimic，用200 μL去酶離心管分裝，-20 ℃冰箱保存；②miRNA-195 mimic con：從-20 ℃冰箱取出解凍離心，加250 μL H2O于5 nmol的miScript mimic negative control中，得終濃度為20 μmol/L的mimic陰性對(duì)照品，用200 μL去酶離心管分裝，-20 ℃冰箱保存；③miRNA-195 inhibitor：從-20 ℃冰箱取出解凍離心，加250 μL H2O于miScript miRNA inhibitor中，得終濃度為20 μmol/L的inhibitor，用200 μL去酶離心管分裝，-20 ℃冰箱保存；④miRNA-195 inhibitor con：從-20 ℃冰箱取出解凍離心，加250 μL H2O，得終濃度為20 μmol/L的inhibitor negative control，用200 μL去酶離心管分裝，-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 RES配制：將RES溶解于二甲基亞砜，0.22 μm一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾滅菌，冷藏備用。實(shí)驗(yàn)前以DMEM培養(yǎng)基稀釋為12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L不同濃度，用CCK-8篩選最佳濃度為50 μmol/L。

1.2.5 RC：空白對(duì)照，用相應(yīng)量的DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HUVECs細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2）。細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)至60%～70%融合，換新鮮培養(yǎng)基，用Lipo2000轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒。36 h后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

1.3.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)：根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(shū)，使用CCK-8分析細(xì)胞活力。100 μL細(xì)胞懸液種植于96孔微板中，然后用不同濃度的低糖（lower glucose,LG）（5 mmol/L）或HG（30 mmol/L）處理細(xì)胞36 h，然后每孔加10 μL CCK-8試劑培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀下選擇波長(zhǎng)450 nm測(cè)定各孔吸光度（OD值）。

1.3.3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄：PCR和實(shí)時(shí)定量PCR根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作。PCR引物見(jiàn)表1。

表1 PCR引物

1.3.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（5×105個(gè)細(xì)胞/孔）接種在6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用200 μL槍尖刮擦來(lái)形成細(xì)胞劃痕，然后用PBS洗滌2次以除去浮動(dòng)細(xì)胞，隨后將每個(gè)孔中的細(xì)胞暴露于無(wú)血清的培養(yǎng)基24 h。使用顯微鏡在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞劃痕進(jìn)行拍照記錄，圖片使用ImageJ軟件測(cè)量。

1.3.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)：在細(xì)胞完成轉(zhuǎn)染后，用胰酶消化液消化成單細(xì)胞懸液，并且用含5% FBS的培養(yǎng)基吹打收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)細(xì)胞/孔，取200 μL細(xì)胞懸液；將Transwell小室在超凈工作臺(tái)中取出放在24孔板中，在小室的下室加入600 μL含20% FBS的培養(yǎng)基；然后將200 μL細(xì)胞懸液加入到上室中，避免氣泡的產(chǎn)生，37 ℃孵箱中培養(yǎng)12 h；12 h后取出小室，用棉簽輕輕拭去上室中細(xì)胞，用PBS洗2遍后棄之，隨后放置于甲醇中固定15 min。取出小室，在室溫中倒置晾干；晾干后將小室放置于結(jié)晶紫中染色20 min；染色完畢后用流水輕輕沖洗小室內(nèi)側(cè)面，用棉簽小心擦去小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞；顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇4個(gè)視野計(jì)數(shù)穿出細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.6 管腔形成實(shí)驗(yàn)：提前1 d將稀釋的Matrigel膠置于4 ℃冰箱溶解，將96孔板、200 μL槍頭置于-20 ℃冰箱冷凍；次日，將96孔板置于冰上，迅速將膠鋪于96孔板內(nèi)，每孔50 μL，將培養(yǎng)板移至37 ℃培養(yǎng)箱放置30 min，以使膠凝固；按常規(guī)方法消化細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，去上清，按組別分別用高糖、低糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×105個(gè)/孔、每孔100 μL的細(xì)胞密度將細(xì)胞種植在鋪有Matrigel的96孔板上；種板后4～6 h于普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 Western blot：將所需數(shù)量的蛋白質(zhì)加載到1.5 mm厚的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。蛋白質(zhì)在Western轉(zhuǎn)移槽中轉(zhuǎn)移到PVDF中，Western轉(zhuǎn)移緩沖液1×（20%甲醇稀釋?zhuān)?，恒定電壓?00 V，1 h）。在5%牛乳中加入0.1% TBST，阻斷PVDF 1 h。封閉后，PVDF與一抗孵育，在5%牛奶TBST中4 ℃稀釋過(guò)夜，然后在TBST中洗滌3次，每次5 min，然后與稀釋于TBST中的合適的過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗孵育1 h，與二抗孵育后，用TBST洗滌3次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)合的二抗。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HG對(duì)HUVECs增殖及miRNA-195 mRNA和Sirt1mRNA表達(dá)的影響 與LG組相比，HG可促進(jìn)HUVECs增殖，并可增加miRNA-195的mRNA表達(dá)，降低Sirt1的mRNA表達(dá)（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 HG對(duì)HUVECs增殖及miRNA-195 mRNA和Sirt1 mRNA表達(dá)的影響

2.2 HG環(huán)境下miRNA-195 inhibitor對(duì)HUVECs中Sirt1表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步了解HG環(huán)境中miRNA-195對(duì)HUVECs的Sirt1影響，分別將LG和HG環(huán)境中的HUVECs轉(zhuǎn)染miRNA-195 mimic質(zhì)粒、miRNA-195 inhibitor質(zhì)粒。結(jié)果顯示：分別與LG組和miRNA-195 mimic con組相比，HG組和miRNA-195 mimic組的miRNA-195 mRNA表達(dá)明顯增加，Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；而在HG環(huán)境下，與miRNA-195 inhibitor con組相比，miRNA-195 inhibitor組中miRNA-195 mRNA表達(dá)明顯降低，Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。以上結(jié)果表明：HG促進(jìn)HUVECs中Sirt1表達(dá)，miRNA-195 inhibitor抑制HUVECs中Sirt1表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2 在HG環(huán)境下，miRNA-195 inhibitor對(duì)HUVECs的Sirt1表達(dá)的影響

2.3 HG環(huán)境下miRNA-195 inhibitor對(duì)HUVECs的FoxO1、Caveolin-1、VEGF表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，分別與LG組和miRNA-195 mimic con組相比，HG組和miRNA-195 mimic組的FoxO1/Caveolin-1/VEGF蛋白表達(dá)顯著增加；而在HG環(huán)境下，與miRNA-195 inhibitor con組相比，miRNA-195 inhibitor組中FoxO1/Caveolin-1/VEGF蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3。結(jié)果表明：HG導(dǎo)致FoxO1的磷酸化減少，Caveolin-1、VEGF的表達(dá)上調(diào)；而miRNA-195 inhibitor使上述現(xiàn)象得到逆轉(zhuǎn)。

圖3 HG環(huán)境下miRNA-195 inhibitor影響HUVECs中FoxO1、Caveolin-1、VEGF的表達(dá)

2.4 HG環(huán)境下miRNA-195 inhibitor影響HUVECs增殖、遷移、侵襲和管腔形成 為明確miRNA-195inhibitor對(duì)HG環(huán)境下對(duì)HUVECs生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，我們檢測(cè)了細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和管腔形成能力。CCK-8結(jié)果顯示：分別與LG組和miRNA-195 mimic con組相比，HG組和miRNA-195 mimic組的細(xì)胞數(shù)量顯著增加；而在HG環(huán)境下，與miRNA-195 inhibitor con組相比，miRNA-195 inhibitor組的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖4A。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：分別與LG組和miRNA-195 mimic con組相比，HG組和miRNA-195 mimic組中HUVECs的遷移能力增強(qiáng)；而在HG環(huán)境下，與miRNA-195 inhibitor con組相比，miRNA-195 inhibitor組中HUVECs的遷移能力顯著減弱（P＜0.05），見(jiàn)圖4B、圖4C。侵襲小室實(shí)驗(yàn)顯示：LG組、HG組、miRNA-195 mimic con組和miRNA-195 mimic組之間，HUVECs侵襲能力未見(jiàn)明顯改變；而在HG環(huán)境下，與miRNA-195 inhibitor con組相比，miRNA-195 inhibitor組的HUVECs侵襲能力顯著減弱（P＜0.05），見(jiàn)圖4D、圖4E。管腔形成實(shí)驗(yàn)顯示：分別與LG組和miRNA-195 mimic con組相比，HG組和miRNA-195 mimic組中HUVECs的管腔形成數(shù)量增加；而在HG環(huán)境下，與miRNA-195 inhibitor con組相比，miRNA-195 inhibitor組的HUVECs的管腔形成數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖4F、圖4G。以上結(jié)果表明：HG促進(jìn)了HUVECs增殖、遷移、侵襲和管腔形成，而miRNA-195 inhibior抑制了HG引起的HUVECs增殖、遷移、侵襲和管腔形成。

2.5 HG環(huán)境下Sirt1激活劑RES影響HUVECs中Sirt1、FoxO1、Caveolin-1和VEGF的表達(dá) 為明確HG環(huán)境中miRNA-195 inhibitor是否通過(guò)Sirt1影響其下游通路，用HG處理HUVECs，同時(shí)RES激活Sirt1，檢測(cè)Sirt1和FoxO1/Caveolin-1/VEGF。RTPCR結(jié)果顯示：與LG組相比，HG組中Sirt1基因表達(dá)下降，而FoxO1和Caveolin-1基因表達(dá)升高（P＜0.05）；在HG環(huán)境下，與RC組相比，RES組中Sirt1基因表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)oxO1和Caveolin-1基因表達(dá)下降（P＜0.05），見(jiàn)圖5A-C。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示：與LG組相比，HG組中Sirt1蛋白水平下降，F(xiàn)oxO1/Caveolin-1/VEGF蛋白增加；在而在HG環(huán)境下，與RC組相比，RES組中Sirt1蛋白水平上升，F(xiàn)oxO1/Caveolin-1/VEGF蛋白下降（P＜0.05），見(jiàn)圖5D-G。以上結(jié)果表明：HG抑制HUVECs中Sirt1的表達(dá)，促進(jìn)FoxO1、Caveolin-1和VEGF的表達(dá)，而RES在HG環(huán)境下促進(jìn)HUVECs中Sirt1的表達(dá)，抑制FoxO1、Caveolin-1和VEGF的表達(dá)。

圖5 HG環(huán)境下Sirt1激活劑RES影響HUVECs中Sirt1、FoxO1、Caveolin-1和VEGF的表達(dá)

2.6 HG環(huán)境下Sirt1激活劑RES影響HUVECs的生物學(xué)行為 為了進(jìn)一步闡明HG環(huán)境下HUVECs的生物學(xué)功能是否受Sirt1的影響，再次檢測(cè)了細(xì)胞的遷移、侵襲能力和管腔形成情況。劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示：與LG組相比，HG組HUVECs遷移能力增加；而在HG環(huán)境下，與RC組相比，RES組HUVECs遷移能力減弱（P＜0.05），見(jiàn)圖6A、圖6B。管腔形成實(shí)驗(yàn)顯示：與LG組相比，HG組HUVECs管腔形成數(shù)量增加；而在HG環(huán)境下，與RC組相比，RES組HUVECs管腔形成數(shù)量減弱（P＜0.05），見(jiàn)圖6C。以上結(jié)果表明：HG促進(jìn)了HUVECs的遷移、侵襲及管腔形成，RES抑制了HUVECs的遷移、侵襲及管腔形成。

圖6 HG環(huán)境下Sirt1激活劑RES對(duì)HUVECs生物學(xué)行為的影響

3 討論

DR是糖尿病患者致盲的主要原因，其病理學(xué)形態(tài)學(xué)主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、微血管球和新生血管形成，最終影響視網(wǎng)膜視神經(jīng)缺氧、凋亡而致盲。近年來(lái)，大量的文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA-195靶向調(diào)節(jié)Sirt1的表達(dá)在糖尿病并發(fā)癥中的作用，然而miRNA-195 inhibitor在其中的作用機(jī)制未明。為了探討miRNA-195 inhibitor對(duì)HG環(huán)境下HUVECs的潛在作用，本研究選用HG（30 mmol/L）處理36 h，發(fā)現(xiàn)HG環(huán)境中HUVECs miRNA-195的mRNA表達(dá)增加，而Sirt1 mRNA表達(dá)降低。提示HG促進(jìn)HUVECs增殖，可能與miRNA-195抑制Sirt1的表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步用miRNA-195 inhibitor干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)Sirt1高表達(dá)，提示在糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞中Sirt1是miRNA-195的作用靶點(diǎn)[9]。

FoxO1是叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子大家族（Foxes）O亞家族的重要成員，廣泛表達(dá)于心臟、血管內(nèi)皮、脂肪等多種器官和組織。FoxO的乙?；?去乙?；?、磷酸化/去磷酸化分別調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性和亞細(xì)胞定位。Sirt1是一類(lèi)NAD+依賴(lài)型去乙?；福ㄎ挥诩?xì)胞核內(nèi)。Sirt1使核內(nèi)Ac-FoxO1去乙酰化而激活核內(nèi)FoxO1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，在DR的發(fā)展過(guò)程中起著調(diào)節(jié)作用[10]。大量的研究發(fā)現(xiàn)：糖尿病機(jī)體或高糖環(huán)境中血管內(nèi)皮細(xì)胞Sirt1的表達(dá)降低，而FoxO1表達(dá)增高[11]，研究結(jié)果與本研究相同。Sirt1的表達(dá)降低，F(xiàn)oxO1表達(dá)增高，這意味著Sirt1對(duì)Ac-FoxO1的去乙?；淖饔媒档?，導(dǎo)致核內(nèi)乙?；腇oxO1累積。乙?；腇oxO1可削弱FoxO1結(jié)合同源DNA序列的能力，進(jìn)而又加強(qiáng)FoxO1的磷酸化，進(jìn)一步降低其轉(zhuǎn)錄活性。另外，磷酸化的FoxO1，使FoxO1由胞核轉(zhuǎn)位至胞漿。

RES是植物合成的天然分子，是公認(rèn)的Sirt1的天然激活劑[11]。文獻(xiàn)報(bào)道FoxOs是Sirt1的底物[12]，它能使FoxO1過(guò)度磷酸化。FoxO1的過(guò)度磷酸化從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)[13]，而位于細(xì)胞核的FoxO1的去磷酸化起到轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，調(diào)節(jié)Caveolin-1啟動(dòng)子區(qū)域，并起到促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的作用[14]。Caveolin-1可以通過(guò)激活A(yù)KT途徑誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生，同時(shí)VEGF可以正向激活A(yù)KT，進(jìn)一步提高VEGF的表達(dá)水平，通過(guò)VEGF-VEGFR系統(tǒng)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)新血管的形成[15]。我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：miRNA-195增高負(fù)向調(diào)節(jié)Sirt1的表達(dá)，進(jìn)一步引起VEGF表達(dá)的增加。本研究結(jié)果表明在HG環(huán)境中，使用miRNA-195 inhibitor促進(jìn)了HUVECs細(xì)胞模中Sirt1的表達(dá)，F(xiàn)oxO1、Caveolin-1、VEGF蛋白水平下降，遷移細(xì)胞數(shù)量、遷移、侵襲能力、管腔形成數(shù)量下降，抑制了新生血管的形成。因此，miRNA-195 inhibitor可能會(huì)抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展，為今后研發(fā)miRNA-195 inhibitor防治DR提供理論依據(jù)。