王華帥，謝 彪，羅 敏，何永恒*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院肛腸科，湖南 長沙 410006；3.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院肛腸科，湖南 長沙 410005）

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是世界上第三大最常見的惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計，2018 年全球新發(fā)癌癥病例總數(shù)為1810 萬例，癌癥死亡人數(shù)為960 萬人，其中，結(jié)直腸癌占總病例的6.1%，占總癌癥死亡人數(shù)的9.2%[2]。 我國《2019 年全國癌癥報告》指出，結(jié)直腸癌依然是我國主要的惡性腫瘤之一，僅次于肺癌和胃癌[3]。 國內(nèi)外研究一致認為，結(jié)直腸癌會造成沉重的社會和經(jīng)濟負擔[4-5]。 目前，認為其發(fā)病涉及腸道菌群、遺傳、年齡和表觀遺傳等因素?，F(xiàn)代臨床常采用手術(shù)、放化療等方法治療結(jié)直腸癌，但術(shù)后患者面臨著生存質(zhì)量低、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、藥物抵抗等困擾，而中醫(yī)藥治療結(jié)直腸癌具有抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、提高免疫力、減輕放化療不良反應(yīng)及延長生存周期等獨特優(yōu)勢[6-7]。

天馬顆粒是由何永恒教授結(jié)合化痞膏、黃芪益損湯、內(nèi)消瘰疬丸三方化裁而成，具有“拔癌毒，消結(jié)腫，通經(jīng)絡(luò)，止疼痛”功效，契合中醫(yī)治療結(jié)直腸癌中“攻、解、化、散、托”法的科學內(nèi)涵。 在臨床使用中，天馬顆粒能有效改善中晚期結(jié)直腸癌患者的全身狀況和生存質(zhì)量，延長患者術(shù)后5 年生存期，抑制大腸癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)[8-11]。在方藥組成、質(zhì)量標準、用藥安全等方面不斷研究、改進[12-16]，現(xiàn)天馬顆粒已獲得專利[17]。

小鼠Friend 病毒綜合因子1（friend leukemia integration 1, FLI-1）在結(jié)腸癌細胞中表達低于正常腸上皮細胞，其過表達可正向調(diào)控Klotho 蛋白表達，抑制結(jié)腸癌細胞增殖[18]。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，以HCT116 細胞為研究對象，基于FLI-1/Klotho通路，探究天馬顆粒對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

人結(jié)直腸癌細胞株（HCT116）購買于武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CL-0096；8 周齡SD 雄性大鼠10 只，體質(zhì)量（200±20） g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證：43072720110-1275856，倫理編號：LLBH-202010130001。

1.2 血清制備

使用10 只SD 雄性大鼠制備天馬顆粒血清。 按照人-動物體表面積關(guān)系換算出大鼠每天中藥等效劑量1.86 g/kg，給予相應(yīng)中藥藥液灌胃，2 次/d，連續(xù)給藥7 d。 第7 天灌胃前禁食8 h，2 次灌胃間隔1 h。 采用腹主動脈采血法，離心、提取血清、過濾、滅活補體，保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.3 主要試劑

天馬顆粒購買于湖南省中醫(yī)院，批準號：[湘]衛(wèi)藥劑9706024，規(guī)格10×10 g/包，用法：成人1 包/次，2 次/d。 將上述藥物加水加熱30 min，使藥物溶解，過濾；在殘渣中繼續(xù)加水加熱30 min，過濾，重復(fù)操作，使得藥物充分溶解，合并濾液，混合濃縮制備成含藥質(zhì)量濃度為0.09 g/mL 的藥液，滅菌后置于4 ℃冰箱保存。

FLI-1 抗體、Klotho 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：A5644、A12028）；β-actin 抗體（美國proteintech 公司，批號：66009-1-Ig）；mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture、DM2000 Plus DNA Marker（中國北京康為世紀公司，批號：CW2569、CW2601、CW0632）；DEPC（美國Sigma 公司，批號：D5758-25ML）；Tris 緩沖液（美國西格瑪公司，批號：V900483）；TRIzol（美國賽默飛公司，批號：15596026）；BCA 蛋白定量試劑盒（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：CW0014S）；EcoRI 限制性內(nèi)切酶、AgeI 限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶（美國NEB 公司，批號：R3101S、R3552S、M0202S）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒（南京諾維贊醫(yī)療科技有限公司，批號：A211、DC201、DC301）。

1.4 主要儀器

流式細胞儀（安捷倫科技公司，型號：Novocyte）；搖床、旋渦混合器（中國江蘇其林貝爾公司，型號：TS-1、GL-88B）；臺式冷凍離心機（中國湖南湘儀公司，型號：H1650R）；熒光PCR 板、熒光定量RCP 儀(美國Thermo 公司，型號：PIKOREAL96、SPL0960)；電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽（中國北京六一公司，型號：DYY-2C、DYCP-31DN）；全自動酶標洗板機、多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號：PW-812、MB-530）。

1.5 細胞培養(yǎng)

HCT116 細胞株采用McCoy′s 5A+1%青-鏈霉素雙抗培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染與分組

轉(zhuǎn)染前一天將生長至對數(shù)期的HCT116 細胞傳代至6 孔板，每孔3×105個細胞。第2 天使用PEI 分別轉(zhuǎn)染FLI-1 shRNA 和空載shRNA 質(zhì)粒[18]，48 h后加入10 μg/mL 的嘌呤霉素進行篩選。

在前期研究中，CCK-8 實驗證明，20%濃度天馬顆粒血清干預(yù)24 h 為HCT116 細胞的最佳干預(yù)條 件[15]；將HCT116 細 胞 分 為blank 組、shRNA 組、shTMKL 組、TMKL 組。 blank 組為空白對照，shRNA組為HCT116 細胞瞬時轉(zhuǎn)染FLI-1 shRNA，shTMKL組為shRNA 組基礎(chǔ)上加入天馬顆粒血清干預(yù)，TMKL 組為天馬顆粒血清干預(yù)HCT116 細胞。 各組細胞培育24 h 后，進行后續(xù)實驗檢測。 所有實驗檢測均重復(fù)3 次。

1.7 Western blot 法檢測FLI-1、Klotho 蛋白表達量

將處理過的細胞經(jīng)胰酶消化后，離心、去上清液，煮沸、變形、電泳，轉(zhuǎn)膜、PBS 洗滌，加入一抗FLI-1(1 ∶1000)、Klotho(1 ∶1000)和 內(nèi) 參β-actin(1 ∶5000)孵育過夜，經(jīng)PBST 洗膜后加二抗孵育、洗膜，采用化學發(fā)光劑顯影，使用Image J 軟件進行灰度分析。

1.8 qPCR 檢測FLI-1、Klotho mRNA 表達

提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以得到的cDNA 為模板，按照qPCR 說明書進行反應(yīng)，檢測FLI-1、Klotho mRNA 水平。運用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。 引物設(shè)計見表1。

表1 PCR 引物序列

1.9 流式細胞術(shù)檢測細胞周期、凋亡

收集處理后的細胞，用預(yù)冷70%乙醇固定細胞30 min，用PBS 洗去乙醇后重新離心收集細胞，加入預(yù)冷RNase 和PI，避光孵育30 min，篩網(wǎng)過濾后用流式細胞儀檢測細胞周期變化。 計算S 期細胞比值（S-phase fraction, SPF)。SPF=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%

收集處理過的細胞，用預(yù)冷PSB 洗滌2 次，1000 r/min、4 ℃，離心半徑17.8 cm，離心5 min，棄上清液，加入300 μL 的1×Binding Buffer 懸浮細胞。加入5 μL 的Annexin V-FITC 和10 μL 的PI 染色液混勻后，避光，室溫孵育15 min。 用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.10 CCK-8 法檢測細胞增殖

將5×103個/mL 細胞液以100 μL/孔接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h 和48 h 時每個孔中分別加入10 μL CCK-8 溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻，培養(yǎng)箱中孵育2 h。使用酶標儀測定450 nm 處A 值。 細胞增殖率=[（對照孔OD 值-實驗孔OD 值）/對照孔OD 值]×100%。

1.11 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，Graphpad Prism 6.0 繪圖，計量資料采用Kolmogorov-Smirnov法檢測數(shù)據(jù)正態(tài)性，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均采用“±s”表示，采用獨立樣本t 檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位間距）描述，行Mann-Whitney U 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 天馬顆粒促進FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 相對表達

與blank 組相比，shRNA 組、shTMKL 組FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 表達量降低（P＜0.05），TMKL組FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 表達量升高（P＜0.05）。與shRNA 組相比，shTMKL 組FLI-1、Klotho蛋白及mRNA 表達量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），TMKL組FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 表達量升高（P＜0.05）。 與shTMKL 組相比，TMKL 組FLI-1、Klotho蛋白及mRNA 表達量升高（P＜0.05）。 詳見表2、圖1。

圖1 各組FLI-1、Klotho 蛋白相對表達

表2 各組FLI-1、Klotho mRNA 相對表達量比較（±s，n=3）

表2 各組FLI-1、Klotho mRNA 相對表達量比較（±s，n=3）

注：與blank 組相比，*P＜0.05；與shRNA 組相比，＃P＜0.05；與shTMKL組相比，＆P＜0.05。

組別blank 組shRNA 組shTMKL 組TMKL 組F 值P 值FLI-1 mRNA 0.94±0.12 0.68±0.05*0.48±0.02*2.21±0.17*＃＆176.24 0.00 Klotho mRNA 2.32±0.51 1.52±0.13*1.54±0.11*3.44±0.36*＃＆23.54 0.00

2.2 天馬顆粒抑制HCT116 細胞增殖

與blank 組相比，shRNA 組HCT116 細胞增殖能力增強（P＜0.05），shTMKL 組、TMKL 組HCT116細胞增殖能力受到抑制（P＜0.05）；與shRNA 組相 比，shTMKL 組、TMKL 組HCT116 細胞增殖能力受 到 抑 制（P＜0.05）；與shTMKL 組相 比，TMKL 組HCT116 細胞增殖能力受到抑制（P＜0.05）。 詳見圖2A、圖2B。

與blank 組相比，shRNA 組SPF 值升高（P＜0.05），shTMKL 組、TMKL 組SPF 值降低（P＜0.05）；與shRNA組相比，shTMKL 組、TMKL 組SPF 值降低（P＜0.05）；與shTMKL 組相比，TMKL 組SPF 值降低（P＜0.05）。詳見圖2C。

與blank 組相比，shRNA 組總凋亡率降低（P＜0.05），shTMKL 組、TMKL 組總凋亡率升高（P＜0.05）；與shRNA組相比，shTMKL 組、TMKL 組總凋亡率升高（P＜0.05）；與shTMKL 組相比，TMKL 組總凋亡率升高（P＜0.05）。詳見表3、圖2D。

圖2 各組HCT116 細胞增殖、凋亡比較

表3 各組HCT116 細胞凋亡比較（±s，n=3）

表3 各組HCT116 細胞凋亡比較（±s，n=3）

注：與blank 組相比，*P＜0.05；與shRNA 組相比，＃P＜0.05；與shTMKL組相比，＆P＜0.05。

組別blank 組shRNA 組shTMKL 組TMKL 組F 值P 值早期凋亡率/%6.16±0.31 0.47±0.08 9.97±0.51 27.87±0.49 2 808.64 0.00晚期凋亡率/%0.22±0.06 0.23±0.04 1.68±0.20 6.83±0.98 117.80 0.00總凋亡率/%6.38±0.30 0.70±0.09*11.65±0.69*＃34.70±1.24*＃＆1 266.77 0.00

3 討論

天馬顆粒由蜈蚣、全蝎、半邊蓮、黃柏、三棱、膽南星、海藻、黃芪、山藥、熟大黃組成。其中君藥全蝎、蜈蚣是現(xiàn)代中藥抗腫瘤常用藥物，廣泛用于治療結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、肺癌、腦癌及胰腺癌等，全蝎、蜈蚣相須為用，有“不可離之性”。 兩藥均入肝經(jīng)，性善走竄，全蝎能穿筋透骨，蜈蚣可通達內(nèi)外，兩藥互助，辛散辛開，相輔相成，寒溫并用，以“毒”攻毒，達到解毒散結(jié)、通絡(luò)止痛功效。 臣藥為半邊蓮、黃柏，二者配伍相須為用，加強清熱解毒功效，助君藥解癌毒、清瘀熱。 佐藥三棱、膽南星、海藻、黃芪、山藥，三棱破瘀行氣、消積止痛；膽南星清熱化痰、息風定驚；海藻能清熱消痰、軟堅散結(jié)；膽南星、海藻配伍加強祛風通絡(luò)、化痰散結(jié)功效；黃芪、山藥益氣養(yǎng)陰、扶正培本、托毒外出。 使藥熟大黃可活血化瘀，使癌毒從下而出，扶正不留邪，配合黃芪攻補兼施?，F(xiàn)代藥理學研究表明，全蝎抗腫瘤成分為蝎毒，后者對抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用機制涉及Bcl-2 信號蛋白及Caspase-9/Caspase-3、AKT、MAPK、NF-κB 等信號通路[19-23]。 有研究[24-25]發(fā)現(xiàn)，蝎毒處理過結(jié)腸癌HCT-8 細胞后，細胞出現(xiàn)凋亡富集現(xiàn)象，可能是由于蝎毒增加ROS、上調(diào)p53、下調(diào)Bcl-2 的表達導致。此外，TAMADON[26]發(fā)現(xiàn)蝎毒可以激活Ca2+通道，進而調(diào)控Wnt 信號通路，促使細胞凋亡。 LI 等[27]對全蝎提取物多肽Gonearrestide 進行體內(nèi)外研究，發(fā)現(xiàn)其能夠通過調(diào)控AKT 信號通路中的負調(diào)控因子PIP3 和PTEN 表達而抑制HCT116 細胞的增殖。 蜈蚣的抗腫瘤成分包括蜈蚣的醚提取物和醇提取物、生物堿以及分離純化后的抗腫瘤蛋白。 在對蜈蚣提取物抗腫瘤活性進行體外篩選時，發(fā)現(xiàn)對多種癌細胞增殖有抑制作用[28]，其中有4 種組分對結(jié)腸癌細胞KM-12 有抑制增殖的作用。 蜈蚣提取液可促進Bax、Bak(促凋亡基因)等基因的表達，從而經(jīng)線粒體通路抑制癌細胞增殖[29]。此外，利用正交實驗設(shè)計驗證了天馬顆粒中的中藥均有抑制結(jié)腸癌細胞增殖的作用，但各個中藥的有效成分還未研究明確[16]。

根據(jù)CCK-8 實驗，與blank 組相比，TMLK 組HCT116 細胞生長受到抑制； 與shRNA 組相比，shTMKL 組HCT116 細胞生長受到抑制。 可知天馬顆粒含藥血清可以有效抑制HCT116 結(jié)腸癌細胞增殖，這與課題組前期研究結(jié)果一致[15，30]。 與blank 組對比，shRNA 組HCT116 細胞增殖能力增強；與shTMKL組對比，TMKL 組HCT116 細胞增殖能力受到抑制。這表明FLI-1 可以抑制HCT116 細胞生長，是抑癌基因。 與blank 相比，shTMKL 組HCT116 結(jié)腸癌細胞增殖受到抑制，說明天馬顆粒抑制HCT116 細胞增殖，可通過FLI-1 蛋白靶點，還可通過其他靶點抑制癌細胞增殖。 G1 期又稱合成前期，此期主要合成RNA 和核糖體。 S 期稱DNA 合成期，除了合成DNA外，同時還合成組蛋白。 DNA 復(fù)制所需相關(guān)酶也在S 期合成。 SPF 值可反映出細胞的增殖能力，在流式細胞周期檢測中，與blank 組對比，TMLK 組SPF 值降低；與shRNA 組對比，shTMKL組SPF 值降低。 說明天馬顆?？山档虷CT116 細胞增殖能力。同blank組對比，shRNA 組SPF 值降低；同shTMKL 對比，TMKL組SPF 值降低。說明FLI-1 表達可影響細胞周期、抑制細胞增殖。 這個結(jié)論同MIAO 等[31]研究結(jié)論一致。同blank 組相比，shTMKL 組SPF 降低，說明天馬顆粒抑制HCT116細胞周期的調(diào)控，可通過FLI-1 蛋白靶點，還可通過其他靶點來調(diào)控。 在雙染法檢測細胞凋亡時，同blank 組對比，TMKL 組總凋亡率升高；同shRNA 組對比，shTMKL 組總凋亡率升高。說明天馬顆?？梢哉T導HCT116 細胞凋亡。 同blank 組對比，shRNA 組總凋亡率降低；同shTMKL 對比，TMKL 組總凋亡率升高， 可知FLI-1 蛋白表達促進HCT116細胞凋亡。而同blank 組對比，shTMKL 組總凋亡率升高，說明天馬顆粒誘導HCT116 細胞凋亡，可通過FLI-1 蛋白靶點，還可通過其他靶點來調(diào)控。 由此可推測，天馬顆粒可抑制HCT116 細胞增殖、誘導凋亡，F(xiàn)LI-1 蛋白具有抑制HCT116 細胞增殖、誘導凋亡的作用。

FLI-1 屬于E26 轉(zhuǎn)錄因子（E26 transformationspecific, ETS）轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，隨著研究的深入，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)FLI-1 在尤文肉瘤、小細胞肺癌、乳腺癌、肝細胞癌等中是促癌基因[32-34]。 而SCHEIBER等[35]研究的結(jié)果卻提示，F(xiàn)LI-1 在乳腺癌中是抑癌基因。 前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LI-1 基因在結(jié)腸癌中屬抑癌基因，可正向調(diào)控Klotho 蛋白表達，抑制IGF-1R 和Wnt3a/β-catenin 信號通路，進而抑制結(jié)腸癌細胞增殖。 本研究qPCR 及Western blot 實驗結(jié)果表明，同blank 組 相 比，TMKL 組FLI-1、Klo tho 蛋 白 及mRNA 表達升高，可認為天馬顆粒能促進HCT116細胞中FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 表達；而同shTMKL 組相比，TMKL 組FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 表達并無差異。結(jié)合前期研究[18]“FLI-1 蛋白可以正向調(diào)控Klotho 蛋白表達”， 可知天馬顆?？梢酝ㄟ^FLI-1 基因調(diào)控Klotho 基因表達。 另外，前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LI-1 啟動子存在甲基化，去甲基化后FLI-1 蛋白表達增加，因此，推測天馬顆粒對FLI-1基因表達的調(diào)控機制可能與啟動子甲基化有關(guān)。

綜上所述，天馬顆?？赏ㄟ^促進FLI-1 基因表達，進而上調(diào)Klotho 蛋白表達，抑制HCT116 細胞增殖、誘導凋亡。