唐明慧 李浩

結核病是由結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)引起的人畜共患病，是全球重要的公共衛(wèi)生問題[1]。我國作為結核病高負擔國家，全國5歲以上人群結核分枝桿菌潛伏感染率為18.08%[2]。因此，提高結核病的診斷和治療技術顯得尤為重要。痰涂片顯微鏡檢查可以通過離心及添加化學試劑如漂白劑和NaOH等來提高檢測敏感度。但其對于不能產(chǎn)生痰液的HIV陽性結核病患者和兒童結核病患者存在局限[3-4]。結核菌素皮膚試驗和γ-干擾素釋放試驗都無法完全區(qū)分活動性結核病和結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)[5]。GeneXpert MTB/RIF或Xpert Ultra成本過高，對于經(jīng)濟落后地區(qū)無疑是一種負擔[6]。

結核病理想的診斷技術是能夠區(qū)分結核病患者、LTBI者及治愈者[7]。與上述檢測技術相比，結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)細胞壁釋放或者細胞表面的脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)作為生物標記物在結核病的診斷中獨具優(yōu)勢，具有區(qū)分LTBI和活動性結核病的潛在價值，對于不能產(chǎn)生痰液的HIV陽性結核病患者及兒童結核病患者的檢測也具有診斷價值，成本相對較低，且痰液中的甘露糖帽修飾的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped-lipoarabinomannan，ManLAM)可作為結核病治療前后細菌負荷量的生物標志物，評價治療效果[7-8]。本文中，筆者將系統(tǒng)介紹LAM的結構、LAM的識別抗體及其表位特征，以及LAM的檢測應用等，旨在為LAM作為結核病免疫學診斷標志物的開發(fā)和應用提供參考。

一、LAM的結構

(一)分枝桿菌屬細胞壁、莢膜及質(zhì)膜相關糖脂

LAM是所有分枝桿菌屬的細胞壁上的一類重要抗原，具有高度免疫調(diào)節(jié)活性，能夠參與宿主與病原體相互作用[9]。根據(jù)不同分枝桿菌的LAM所修飾的帽不同，MTB、牛分枝桿菌、麻風分枝桿菌等慢生長致病性分枝桿菌主要是ManLAM，恥垢分枝桿菌等快生長的非致病性分枝桿菌是磷脂酰肌醇帽修飾的脂阿拉伯甘露聚糖(phosphatidyl-myo-inositol capped LAM，PILAM)[10-11]。MTB的ManLAM由α-(1→2)-連接的吡喃甘露糖苷(mannopyranose，Manp)單糖、二糖和三糖單元廣泛封端，ManLAM的甘露糖帽介導抑制促炎反應[12]。而PILAM的磷脂酰肌醇帽能誘導人類巨噬細胞分泌促炎細胞因子[13]。

MTB的細胞壁核心主要由3個結構組成：特征性長鏈分枝菌酸、高度分支的阿拉伯半乳聚糖多糖 (arabinogalactan，AG)和交聯(lián)的肽聚糖。MTB的細胞壁上含甘露糖的糖脂有ManLAM、脂甘露聚糖(lipomannan，LM)及甘露糖苷(mannosides，PIM)，其親水部分位于質(zhì)膜空間，并通過其脂質(zhì)部分鑲嵌于質(zhì)膜，外膜也存在這些糖脂，發(fā)揮調(diào)節(jié)蛋白和黏附素的作用[14-15]。MTB最外層莢膜多糖主要由葡聚糖(70%～80%)、阿拉伯甘露聚糖(arabinomannan，AM；10%～20%)和甘露聚糖組成[16]。具體見圖1。

注 LAM：脂阿拉伯甘露聚糖；AM：阿拉伯甘露聚糖；LM：脂甘露聚糖；PIM：甘露糖苷；AG：阿拉伯半乳聚糖多糖；TMM：海藻糖單菌酸鹽；TDM：海藻糖二霉菌酸酯圖1 結核分枝桿菌莢膜、細胞壁、質(zhì)膜糖脂相關成分

(二)LAM的結構及其生物合成

ManLAM是國外研究最為廣泛的結核病診斷標志物，是一種高度支化的脂聚糖[相對分子質(zhì)量為(17.3±5.0)×1000]，由甘露糖基磷脂酰肌醇錨、甘露糖核心骨架、阿拉伯聚糖結構區(qū)域和甘露糖帽四部分組成，約占細菌總干重的15%[17]。細胞膜成分磷脂酰肌醇在一系列酶的作用下甘露糖基化、?；纬蒔IM，異質(zhì)性的PIM常見有PIM2和PIM6。Ac1PIM4和Ac2PIM4是形成糖基化終產(chǎn)物LAM和LM的常見中間產(chǎn)物。LAM是在LM中加入55～70個阿拉伯糖苷產(chǎn)生的[14]。ManLAM比LM多阿拉伯聚糖及帽子結構，它們對于分枝桿菌細胞壁的完整性及發(fā)揮致病作用十分重要[9, 18]。PIM和LM不具備單抗親和力或者親和力低[19]。AM是一種中性且異質(zhì)的莢膜多糖，AM被脂化時形成LAM，是LAM的免疫原性組成部分(圖2)。MTB糖脂PIM、LM、LAM存在共同成分，存在相互競爭或協(xié)同適應性細胞和固有細胞受體，在MTB感染期間產(chǎn)生免疫反應[20]。

注 Manp：吡喃甘露糖苷；D-Araf：D-阿拉伯糖苷；MTX-Man2帽：5-甲硫基-D-木呋喃糖-二甘露糖帽；MPI：甘露糖基磷脂酰肌醇；PI：磷脂酰肌醇；LM：脂甘露聚糖；ManLAM：甘露糖帽修飾的脂阿拉伯甘露聚糖；Ac1PIM2：一?；姿峒〈级事短擒?；Ac1PIM4：一酰化磷酸肌醇四甘露糖苷；Man：甘露糖；Ac：?；?；Ara4：四阿拉伯糖苷；Ara6：六阿拉伯糖苷；甘露糖基轉移酶：PimA、PimB’、PimC、PimE、MptA和 MptB；阿拉伯呋喃糖基轉移酶：EmbC、AftD、ArafT；甘露糖帽合成酶：CapA和 MptC圖2 脂阿拉伯甘露聚糖的結構與生物合成及相關抗體結合表位

ManLAM具有一定的異質(zhì)性。體內(nèi)及體外培養(yǎng)、不同結核病流行地區(qū)的MTB臨床分離株ManLAM的結構也存在差異[21-22]。阿拉伯聚糖結構中有一條線性Ara4和一條支鏈Ara6[9]，是抗體主要識別的表位區(qū)域。5-甲硫基-D-木呋喃糖(5-methylthio-d-xylofuranose，MTX)-甘露糖帽是MTB的ManLAM特有結構[23]，該表位對于MTB具有特異性，而麻風分枝桿菌和恥垢分枝桿菌缺少[24]。

(三)ManLAM來源、分布及應用

LAM可以在體外培養(yǎng)的分枝桿菌中提取，?；腖AM具有極性，且溶于水[21, 25]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過熱滅活的分枝桿菌其表面的LAM會減少[26]。據(jù)推測，LAM是分枝桿菌有機體活性代謝或者降解釋放的產(chǎn)物。巨噬細胞吞噬菌體主動分泌LAM，后者以凋亡小體的形式傳遞到抗原提呈細胞，從而促進T淋巴細胞活化，還能抑制細胞因子的產(chǎn)生、吞噬溶酶體成熟、巨噬細胞的凋亡和自噬，促進白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)表達從而延緩機體對MTB的清除[27]。LAM在血液中以單體形式不穩(wěn)定，便在血清中與高密度脂蛋白等載體分子結合，經(jīng)過血液循環(huán)，流經(jīng)腎臟。LAM具有抗原性，導致不能直接通過腎小球，以免疫復合物的形式通過腎臟過濾進入尿液，因此，尿液中的LAM濃度高于血清[28-29]。很多研究都證實了結核病患者的尿液[17]、唾液[8, 30]、血液[31]中存在LAM，結核病病牛的牛奶也可以檢測出LAM[32]。LAM化學性質(zhì)相對穩(wěn)定，比較耐熱[33]，耐蛋白酶，無論新鮮尿液還是凍存尿液都不影響其檢測[34]。這也增加了LAM在臨床適用的靶向性。

ManLAM能被人類CD1b限制性T細胞識別并激活。利用這個特點，相關糖蛋白疫苗不斷誕生[35]。AM抗體可以用于合并HIV感染的結核病患者的診斷[36]，但是由于接種卡介苗也會產(chǎn)生相應抗體，且檢測不穩(wěn)定，世界衛(wèi)生組織不建議抗ManLAM抗體用于血清學診斷[7]。接種卡介苗的牛產(chǎn)生的抗LAM的抗體主要為IgG2和IgG1，且能通過胎盤屏障進入初乳[37]。針對分枝桿菌細胞壁成分的抗體具有免疫保護作用，抗ManLAM或AM抗體在MTB感染期間和卡介苗接種后均被誘導，LTBI者或者接種卡介苗的健康人體內(nèi)的抗AM的IgG具有保護作用，有調(diào)理吞噬作用的活性[38-40]，而活動性結核病患者體內(nèi)的抗體往往不具有保護作用，其相關ManLAM抗體親和力低且IgG/IgM比值低[41]。

二、ManLAM相關單克隆抗體

針對ManLAM的單克隆抗體有很多，一般來說人源性抗體不適用于診斷人類結核病，因為這些抗體在用于人體標本檢測時會產(chǎn)生較深的背景染色[42]。相比之下，其他類型的抗體用于人體標本的檢測更占優(yōu)勢。此外，抗體的亞型也影響著LAM的檢測。研究發(fā)現(xiàn)，體外純化的LAM更傾向于與IgG2結合[43]。但檢測樣本抗體的亞型往往是IgG1和IgG3，導致這類現(xiàn)象的原因可能是感染MTB后不同時期階段分泌的抗體有所差異，也有可能是機體內(nèi)外的LAM表位有所差異。

電化學發(fā)光免疫檢測評估了各種針對LAM表位的單克隆抗體，結果顯示，雖然許多抗體能夠與純化的LAM發(fā)生特異性結合，但是應用于臨床標本時，檢出率偏低。這更加證實了高度異質(zhì)性的LAM的結構及不同抗體針對的表位存在明顯差異[24]。 針對ManLAM的抗體有很多，具體見表1。

表1 針對ManLAM的單克隆抗體

(一)鼠源性抗體

CS-35是將粗糖免疫小鼠后通過麻風分枝桿菌的LAM提取的乙醇沉淀物來篩選的針對麻風分枝桿菌的鼠源性抗體[44]。CS-35是廣譜單克隆抗體，對LAM、AG及AM都識別，對分支Ara6表位具有優(yōu)先親和力，還與線性Ara4和Ara5結合[45]。CS-35的反應性對是否存在甘露糖帽完全不敏感。CS-40是針對MTB的Erdman株的ManLAM產(chǎn)生的鼠源性抗體，識別LAM和AM，與未加帽的Ara4表位結合較弱，但優(yōu)先識別以單個Manp殘基和MTX 衍生物為帽的Ara4和Ara6結構[46-47]。CS-40識別ManLAM的同時也識別PILAM，PILAM雖然沒有任何甘露糖帽修飾的結構，導致交叉反應性可能是CS-40與未修飾的Ara4聚糖的反應性介導的[46]。FIND家族抗體只識別Ara6，不識別Ara4，對Manp殘基不敏感[46]。鼠源性抗體面臨的問題是抗體產(chǎn)量低，并且溶解性低導致無法純化。

(二)人源性抗體

A194是從1例接受抗生素治療的活動性肺結核患者記憶B細胞得到的抗體[46]。A194主要針對ManLAM的阿拉伯聚糖的Ara4和Ara6表位，以及對甘露糖帽結構的一個子集[24]。與其他抗體不同的是，A194的表位基本上存在于所有ManLAM分子。除了CS-40，A194不與其他單克隆抗體競爭表位結合[46]。使用MTB的AM作為探針篩選來自未感染或者暴露人群的高抗AM IgG，可產(chǎn)生針對AM 聚糖表位且無交叉反應性的單克隆抗體，例如T1AM04和T1AM09[48]。My2F12是從人類非免疫Fab-Ab噬菌體展示文庫中分離出來組成的人鼠嵌合抗體。該單克隆抗體具有接近親本的親和力，與PILAM無交叉反應[42]。

(三)兔源性抗體

MoAb1通過噬菌體展示技術從用卡介苗免疫兔產(chǎn)生的scFv文庫分離得到重組單克隆抗體[26]，主要識別ManLAM的MTX帽[22]。雖然MTX是MTB ManLAM的特有部位，但是MTX封端殘基以低豐度存在，通常每個ManLAM分子只有1個MTX殘基，所以，這有可能導致檢測的敏感度降低[23]。BJRbL01和BJRbL03是用MTB標準株H37Rv細胞壁免疫兔子，再通過噬菌體展示技術篩選出針對ManLAM 的抗體[49]，能區(qū)分慢生長的MTBC和快速生長的非結核分枝桿菌。S4-20和FIND28均能檢測HIV陰性結核病患者的ManLAM，且能很好排除環(huán)境中潛在的非結核分枝桿菌的干擾[8, 24]。

三、ManLAM檢測方法的研發(fā)和應用

尿液LAM檢測可以作為一個重要的診斷工具，抗原LAM具有反映分枝桿菌負荷量的潛在優(yōu)勢，且尿液與痰液相比，前者在實驗室處理比較安全[3, 50]，見表2。研究表明，尿液LAM檢測有可能提高合并HIV感染的結核病患者的診斷率[51]。世界衛(wèi)生組織2016年建議的側流尿脂阿拉伯甘露聚糖測定法(lateral flow lipoarabinomannan assay，LF-LAM)測定LAM適用于CD4+T淋巴細胞≤100 個/μl的HIV陽性結核病患者[52]，該檢測方法敏感度較低[53]。全球大部分結核病患者是HIV陰性，找到適用于此類人群檢測的方法十分重要。相比之下，日本的FujiLAM(Fujifilm SILVAMP TB LAM)使用了針對主要MTB特異性LAM表位的高親和力單克隆抗體，并增加了銀擴增步驟。該檢測在成人中檢測結核病的敏感度為75%，檢測兒童結核病的敏感度為64%。該試劑盒適用于HIV陽性結核病患者的臨床診斷，對于身體狀況較差的兒童結核病患者也具有診斷價值，可以彌補GeneXpert MTB/RIF檢測遺漏的結核病患者[34, 54-56]。

表2 結核分枝桿菌ManLAM的相關檢測

CD4+T淋巴細胞≤100個/μl的HIV陽性結核病患者尿液LAM的濃度大于10 ng/ml，而CD4+T淋巴細胞計數(shù)高的HIV陽性結核病患者尿液LAM的濃度約為10～1000 pg/ml[24]。A194及S4-20單克隆抗體能檢測絕大多數(shù)HIV陰性結核病患者[24]。關于HIV陰性結核病患者尿液的LAM檢出率低的原因，大概有3種推測：一是標本中的蛋白與LAM絡合在空間上阻礙了LAM抗原與抗體的特異性結合，循環(huán)中的抗LAM抗體也影響血清中LAM的檢測[57]。二是當MTB感染腎臟或者腎功能不全時，LAM抗原才可以直接從感染組織進入尿液中[58-59]。三是LAM具有高度異質(zhì)性，大部分抗體針對的是從培養(yǎng)基中提取的LAM，但臨床樣本與培養(yǎng)基中LAM所呈現(xiàn)的表位不同，這便導致了檢測敏感度的降低[21]。如果檢測技術的敏感度足夠高，測定HIV陰性結核病患者的血清和尿液中的LAM是完全可行的[60]。電化學發(fā)光測量尿液中的LAM比血清的準確性更高[33]。除了與LAM結合的免疫復合物，基質(zhì)組分如氨基酸、多肽、脂質(zhì)、代謝終產(chǎn)物等也會掩蓋或者改變LAM表位。有研究者即使用蛋白酶或者酸來破壞樣本中大分子物質(zhì)，從而提高診斷敏感度和準確性[42, 61-62]。去酰基化的LAM和保留Ara6豐度也能提高檢測敏感度[21]。

HIV陰性結核病患者細菌負荷量相對HIV陽性結核病患者低，導致前者尿液LAM濃度偏低。結核病的發(fā)展階段、合并癥、器官菌載量、感染情況等可能會導致患者機體的LAM分布發(fā)生變化。例如，抗體糖表位類別對糖尿病與結核病共病患者尿液中的LAM具有不同的敏感度，也就使得不同抗體對于糖尿病與結核病共病患者檢測敏感度有所不同[22]。

Crawford等[57]將金納米顆粒(AuNP)標記抗體做夾心法ELISA，利用表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)檢測血清中的ManLAM，放大了檢測信號。藍藻凝集素與ManLAM的甘露糖有較高親和性，藍藻凝集素功能化磁珠的ELISA檢測尿液中ManLAM效果較好[63]。Paris等[64]設計水凝膠納米籠，應用高親和力銅絡合物染料捕獲ManLAM，排除其他物質(zhì)的干擾，大大提高了檢測敏感度。Wood等[65]將等離子體光柵與抗LAM捕獲抗體結合，一同與患者尿液樣本和生物素化檢測抗體孵育，該檢測結果滿足世界衛(wèi)生組織所建議的檢測敏感度(>65%)和特異度(>98%)要求，為針對LAM抗體的現(xiàn)場快速檢測提供技術支持。Broger等[33]利用電化學發(fā)光免疫測試測量HIV陽性和陰性結核病患者尿液和血清中LAM，敏感度分別可達到93%和55%。Divagar等[66]利用等離子體光纖吸光度生物傳感器檢測ManLAM，在U型彎曲光纖探針上進行等離子體夾心免疫測定，在緩沖液和合成尿液中ManLAM的檢測限分別低至 1 fg/ml和10 fg/ml。

核酸適體與抗體類似，具有易修飾、高親和力、高特異性等優(yōu)點。Tang等[67]通過指數(shù)富集方法從北京基因型MTB菌株中制備一種針對MTB的ManLAM特異的單鏈 DNA 適體(T9)“抗體”，T9對血清或痰液中的ManLAM具有較高的親和力，用于免疫組織化學檢測可使檢測敏感度明顯提高[68]。

四、結語

ManLAM具有免疫調(diào)節(jié)的功能，作為結核病的診斷標記物獨具優(yōu)勢。但是國內(nèi)目前使用相關診斷標記的方法較少。在檢測活動性結核病患者ManLAM時，為了提高檢測敏感度，可以從三方面入手：一是解決從大容量樣本中獲取低濃度的ManLAM或者克服基質(zhì)反應的問題。因HIV陰性結核病患者細菌負荷量較低，導致體內(nèi)ManLAM濃度低，需要將夾心ELISA或者免疫層析法與其他技術聯(lián)用來放大檢測信號，從而提高檢測敏感度和特異度。樣本中存在免疫復合物、大分子蛋白、反應抑制劑等，采用適當?shù)臉颖绢A處理技術可以進一步提高檢出率。二是獲得高質(zhì)量的單克隆抗體。由于ManLAM具有高度異質(zhì)性，獲取具有高特異性、高親和力，且針對單一表位的抗體是有難度的。體外提取的ManLAM和內(nèi)源性ManLAM抗體表位存在一定差異，而市面上大多抗體都是針對體外提取的ManLAM，采用B淋巴細胞篩選技術從患者體內(nèi)獲取的抗體來檢測ManLAM 效果可能會更佳。另外，尋找抗體的代替品例如核酸適配體來檢測ManLAM也是不錯的選擇。第三是增加MTB新型標記物。診斷試劑盒的開發(fā)除了利用ManLAM外，還可以利用MTB分泌的早期分泌抗原靶6和培養(yǎng)濾液蛋白10輔助檢測，從而提高診斷的準確性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻唐明慧：起草文章初稿，初稿修改，文獻查閱及校對；李浩：內(nèi)容審核及校對