徐維華 李曉龍 張強(qiáng) 宋愛(ài)芬 高麗云 李劍英 韓洪利

(1 煙臺(tái)市蓬萊人民醫(yī)院普外科，山東 煙臺(tái) 265600；2 天津市第三中心醫(yī)院胸外科)

肺癌是人類目前全球發(fā)病率、病死率最高的惡性腫瘤之一[1]，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌較常見(jiàn)的組織病理學(xué)類型。早期無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的N0期NSCLC患者是手術(shù)治療的最佳受益人群，但是，目前尚缺乏能夠早期診斷NSCLC的特異性腫瘤標(biāo)志物。因此，尋找靈敏度和特異度高的早期診斷標(biāo)志物是目前臨床亟待解決的問(wèn)題。近幾年，研究人員利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，通過(guò)比較分析癌旁正常組織與癌組織細(xì)胞內(nèi)整體蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，對(duì)差異表達(dá)蛋白(DEPs)進(jìn)行鑒定和定量分析，從而篩選出與腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物，為臨床進(jìn)行腫瘤診斷和治療提供數(shù)據(jù)參考[2-3]。本研究采用的是蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析方法，以N0期NSCLC患者為研究對(duì)象，比較癌組織及癌旁正常組織中DEPs，篩選和鑒定N0期NSCLC患者的腫瘤標(biāo)記物，為NSCLC的早期診斷提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

收集2018年9月—2020年12月于煙臺(tái)市蓬萊人民醫(yī)院收治的確診為N0期NSCLC并行胸腔鏡下肺癌根治術(shù)的30例患者的癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤組織≥5 cm)樣本，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療或射頻消融等治療，且術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)檢查明確診斷。患者中位年齡64(55，73)歲，術(shù)后TMN分期為Ⅰa期～Ⅰb期，腫瘤分型包括鱗癌5例，腺癌25例。

1.2 串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)篩選NSCLC癌組織和癌旁正常組織DEPs

委托上海拜普生物科技有限公司采用TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)完成30例N0期NSCLC患者的癌組織及癌旁正常組織樣本的蛋白質(zhì)提取、定量、酶解、肽段的TMT標(biāo)記、High-pH 反相色譜柱分級(jí)、液相二級(jí)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分析、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。使用Sequest HT搜索引擎檢索UniProt-Homo sapiens (Human)[9606]-203800-202201.fasta數(shù)據(jù)庫(kù)，后將LC-MS/MS分析獲得的RAW文件導(dǎo)入Proteome Discoverer 軟件當(dāng)中(版本號(hào) 2.4, Thermo Scientific)，將格式轉(zhuǎn)化為肽段/蛋白表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)。使用Perseus軟件(1.6.12.0)、R統(tǒng)計(jì)計(jì)算軟件(4.0.5)以及Excel軟件對(duì)上述的數(shù)據(jù)的結(jié)果進(jìn)行質(zhì)譜分析，以變化倍數(shù)(FC)>1.2或者<1/1.2，并且以Studentt檢驗(yàn)P<0.05作為篩選DEPs的條件。

1.3 DEPs的GO功能和KEGG通路分析

分別對(duì)篩選出的上調(diào)和下調(diào)的DEPs從生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分3個(gè)方面進(jìn)行GO功能分析，選擇P值較小的4種生物過(guò)程。對(duì)上述DEPs進(jìn)行KEGG通路的注釋與富集，依據(jù)Fisher精確檢驗(yàn)法對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行富集分析，以P<0.05為顯著富集，P值越小表示富集越顯著，選擇3種P值較小的通路。同時(shí)對(duì)各通路的基因重疊率進(jìn)行比較分析，獲得基因重疊率具有顯著差異的通路。

1.4 DEPs功能互作網(wǎng)絡(luò)(PFIN)分析

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.6.1軟件對(duì)篩選出的DEPs構(gòu)建PFIN并進(jìn)行PFIN分析，明確DEPs之間的相互作用關(guān)系。

1.5 對(duì)DEPs進(jìn)行平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(PRM)分析

結(jié)合GO功能、KEGG通路和PFIN分析結(jié)果，篩選出同時(shí)參與了上面4種生物過(guò)程及3種KEGG通路并且相互作用關(guān)系緊密的DEPs，委托上海拜普生物科技有限公司采用PRM技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，以FC>1.2或<1/1.2為驗(yàn)證條件，最終通過(guò)驗(yàn)證的DEPs稱為靶向DEPs。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC患者癌組織和癌旁正常組織的DEPs

對(duì)30例患者的癌組織和癌旁正常組織樣本進(jìn)行TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共發(fā)現(xiàn)91種DEPs，其中14種(如HSP90B1、SERPINH1、KRT8等)表達(dá)上調(diào)，77種(如COL6A3、AHNAK、C3等)表達(dá)下調(diào)。

2.2 DEPs的G0功能、KEGG通路和PFIN分析

對(duì)91種DEPs進(jìn)行GO功能分析，選擇P值較小的4種生物過(guò)程，結(jié)果顯示，14種上調(diào)DEPs分別參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)折疊及對(duì)過(guò)氧化氫的反應(yīng)等生物過(guò)程；77種下調(diào)DEPs分別參與了細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)及內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控等生物過(guò)程。

對(duì)91種DEPs進(jìn)行KEGG通路分析結(jié)果顯示，14種上調(diào)DEPs主要參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、甲狀腺激素合成、糖酵解/糖異生、低氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路等KEGG通路；77種下調(diào)DEPs主要參與了補(bǔ)體途徑、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏著斑、蛋白質(zhì)消化和吸收、維生素的消化和吸收、阿米巴病、人乳頭瘤病毒感染、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路、脂肪消化和吸收、膽固醇代謝、百日咳、氮代謝、癌癥中的蛋白聚糖、小細(xì)胞肺癌、弓形蟲病、酸分泌收集管等KEGG通路。其中，對(duì)通路的基因重疊率進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示，細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏著斑、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路、人乳頭瘤病毒感染4條通路之間基因重疊率具有顯著差異(P<0.01)，維生素的消化和吸收、脂肪消化和吸收、膽固醇代謝3條通路之間基因重疊率具有顯著差異(P<0.01)，阿米巴病與小細(xì)胞肺癌2條通路之間基因重疊率也具有顯著差異(P<0.01)。

對(duì)篩選出的91種DEPs通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PFIN，見(jiàn)圖1，圖中各節(jié)點(diǎn)為DEPs，節(jié)點(diǎn)之間的連線為DEPs之間的相互作用關(guān)系，連線越多表示各DEPs間的相互作用越緊密。

2.3 DEPs的PRM分析

結(jié)合GO功能、KEGG通路和PFIN分析的結(jié)果，從91種DEPs中篩選出30種同時(shí)參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程和蛋白質(zhì)結(jié)合(P值較小的4種生物過(guò)程)以及參與了細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏著斑以及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路(P值較小的3種KEGG通路)DEPs，經(jīng)PRM驗(yàn)證后最終獲得25種靶向DEPs，其中上調(diào)DEPs 4種，具體分別為熱激蛋白90β亞家族成員1(HSP90B1)、熱激蛋白D亞家族成員1(HSPD1)、二硫鍵異構(gòu)酶家族A成員6(PDIA6)和PDIA4；下調(diào)DEPs 21種，分別為α-1-Ⅵ型膠原蛋白(COL6A1)、COL6A2、COL6A3、絲氨酸蛋白酶抑制劑A亞家族成員1(SERPINA1)、SERPINA3、絲氨酸蛋白酶抑制劑C亞家族成員1(SERPINC1)、SERPIND1、SERPING1、α-5-層粘連蛋白亞基(LAMA5)、LAMB2、LAMC1、碳酸酐酶1(CA1)、CA2、含EH結(jié)構(gòu)域的膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白1(EHD1)、EHD2、EHD4、富亮氨酸-α-2-糖蛋白(LRG1)、間-α-胰蛋白酶抑制重鏈蛋白4(ITIH4)、觸珠蛋白(HP)、α-2-巨球蛋白(A2M)、膜聯(lián)蛋白A3(ANXA3)。

A：上調(diào)DEPs，B：下調(diào)DEPs圖1 DEPs的PFIN分析圖Fig.1 PFIN Analysis of DEPs

3 討 論

肺癌是我國(guó)發(fā)病率、死亡率最高的幾種惡性腫瘤之一，早期診斷率低，很多患者在確診時(shí)即已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，因此患者的總體預(yù)后較差。腫瘤標(biāo)志物是與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的分子信號(hào)，對(duì)腫瘤的診斷、治療及患者的預(yù)后及復(fù)發(fā)具有評(píng)估或預(yù)測(cè)價(jià)值。目前臨床通常采用TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選腫瘤相關(guān)蛋白或腫瘤標(biāo)志物。本研究通過(guò)TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共篩選出N0期NSCLC患者癌組織和癌旁正常組織DEPs共91種，結(jié)合DEPs的GO功能、KEGG通路、PFIN分析結(jié)果，再?gòu)闹泻Y選出30種DEPs，經(jīng)PPM驗(yàn)證最終篩選出25種靶向DEPs，其中上調(diào)DEPs 4種，下調(diào)DEPs 21種。

研究發(fā)現(xiàn)，PDIA4、PDIA6主要參與凝血、損傷反應(yīng)、T細(xì)胞遷移和癌癥轉(zhuǎn)移等重要生物過(guò)程，其中PDIA4通過(guò)活化血小板促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[4-5]，PDIA6可調(diào)節(jié)膀胱癌[6]和NSCLC細(xì)胞[7]的細(xì)胞增殖和侵襲。另外熱激蛋白(HSP)主要生理功能為維持細(xì)胞完整性，參與熱激反應(yīng)，通過(guò)上調(diào)其表達(dá)量從而保護(hù)細(xì)胞免受外界侵害[8]。但是有研究發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)參與凋亡、自噬、血管生成和腫瘤免疫等多種細(xì)胞過(guò)程促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9]。

SERPINA1、SERPINA3、SERPINC1、SERPIND1、SERPING1均屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑的家族成員，本研究發(fā)現(xiàn)其在N0期NSCLC組織中表達(dá)水平顯著下降，對(duì)DEPs進(jìn)行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這5種DEPs共同參與了補(bǔ)體與凝血系統(tǒng)的代謝通路。C4BP蛋白主要由肝臟分泌，在血液中為中等豐度，可能與機(jī)體對(duì)腫瘤的應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān)。

COL6A蛋白在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)病灶黏附與轉(zhuǎn)移來(lái)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)以及侵襲[10]。既往研究表明COL6A1在轉(zhuǎn)移性NSCLC中高表達(dá)，并且其表達(dá)水平降低能夠抑制NSCLC的轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果顯示COL6A在肺癌組織中的表達(dá)水平較癌旁正常組織顯著降低，推測(cè)可能與研究對(duì)象不同有關(guān)，本研究中納入的是無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的N0期NSCLC患者組織。

CA1與CA2是碳酸酐酶家族成員，可以催化CO2/H2CO3的可逆水合和脫水反應(yīng)。其中，CA1起維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中CA1蛋白和基因表達(dá)水平均下調(diào)，其在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)提示手術(shù)效果及預(yù)后好[13]。而CA2作為CA1的同源基因，是肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制劑，并且與肝癌患者的總體生存期具有密切的相關(guān)性[14]。本研究結(jié)果顯示CA1、CA2在N0期NSCLC組織中表達(dá)下調(diào)。

EHD1、EHD2、EHD4是EHD家族的重要成員。研究表明EHD1高表達(dá)與NSCLC進(jìn)展及預(yù)后不良有關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)EHD2在腎癌組織中高表達(dá)[16]，另有研究發(fā)現(xiàn)EHD2能夠激發(fā)NSCLC細(xì)胞的增殖和糖酵解，但抑制自噬和細(xì)胞凋亡，因此提示EHD2可能是NSCLC的潛在治療靶點(diǎn)，且有成為NSCLC的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛能[17]。研究發(fā)現(xiàn)EHD2在乳腺癌組織、肝癌組織及NSCLC等癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織[18-19]，本研究結(jié)果與此一致，但具體機(jī)制尚待深入探討。

LAM具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、黏附和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)效應(yīng)。LAM家族中的LAMA2屬于抑制基因，其高表達(dá)能夠抑制非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，LAM家族中的LAMA5、LAMB2以及LAMC1在N0期NSCLC癌組織中表達(dá)較癌旁正常組織顯著下調(diào)。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)N0期NSCLC患者癌組織及癌旁正常組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，尋找發(fā)現(xiàn)了25種DEPs，可為NSCLC的早期診斷提供線索和依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明本文章不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)煙臺(tái)市蓬萊人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。所有試驗(yàn)過(guò)程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of Yantai Penglai People’s Hospital, and all experimental protocols were carried out by following the guidelines of The Declaration Helsinki. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)：徐維華、韓洪利參與了研究設(shè)計(jì)；徐維華、李曉龍、張強(qiáng)、宋愛(ài)芬、高麗云、李劍英參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byXUWeihuaandHANHongli. The manuscript was drafted and revised byXUWeihua,LIXiaolong,ZHANGQiang,SONGAifen,GAOLiyun, andLIJianying. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.