劉幫助 劉小霞 李茜 鮑姨琴 李世榮 楊剛 黃禮年

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer ，NSCLC)患者盡管引入了靶向治療和最近的免疫檢查點抑制劑改變了NSCLC的預(yù)后，其中2年生存率從 34% 增加到 42%，但肺癌5年生存率僅為21%[1]。這取決于腫瘤的生物學(xué)特性，其中血管生成是腫瘤重要的預(yù)后因素[2]。腫瘤血管生成受多種促血管生成因子和抗血管生成因子的復(fù)雜相互作用調(diào)節(jié)[3]。血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)是迄今為止已知的最有效和最特異的促血管生成因子；它在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成中起著關(guān)鍵作用[4]，除了VEGF-A，其他因子在腫瘤血管生成中也可能發(fā)揮重要作用。黑色素瘤相關(guān)抗原A3 (melanoma-associated antigen A3, MAGE-A3)廣泛表達于多種腫瘤細胞中，且與腫瘤的發(fā)生、侵襲及預(yù)后不良有關(guān)。因此，本研究將探討MAGE-A3在NSCLC中的表達與血管生成關(guān)系，及其與臨床療效的相關(guān)性。

資料與方法

一、.一般資料

選取2016年2月～2020年3月我科145例病理證實為NSCLC患者，男80例(55.17%)，女65例(44.83%)，年齡58～77歲，中位年齡67.5歲，≥60歲102例(70.34%)，<60歲43例(29.66%)。肺鱗癌90例，腺癌55例，其中有人類表皮生長因子受體(EGFR)突變29例，19外顯子缺失突變18例(62.07%)和21外顯子L858R點突變11例(37.93%)。入組標準：(1) Karnofsky評分均>70 分；(2) 預(yù)期生存時間>3個月; (3) 無化療、靶向及免疫治療禁忌證； (4) 本次治療前未使用過相關(guān)治療藥物。排除標準：(1)心肝腎功能不全； (2) 凝血功能障礙；(3)研究中使用的藥物過敏的患者。主要研究終點：總生存期(Overall survival ，OS)。隨訪方法：采用電話或在院訪問的方式進行隨訪，失訪者或不能耐受化療毒副作用停藥未進行計算。OS：從第1次抗腫瘤治療開始至患者死亡，隨訪截止時間為2021年9月，該研究通過我院倫理委員會批準(20160017)。

二、方法

1 主要試劑：免疫組化試劑盒(R&D公司)。VEGF-A、CD34單克隆抗體，MAGE-A3多克隆抗體(Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG抗體(Santa Cruze公司)，SP復(fù)合物(DAKO公司)。H1299細胞株由弋磯山醫(yī)院中心實驗室提供，LV3-MAGE-A3 RNAi慢病毒干擾載體及陰性對照LV3-NC由上海吉凱基因公司合成，噻唑藍(MTT)試劑盒(Sigma公司)，引物合成(上海生工生物工程有限公司) 。

2 NSCLC患者S-P免疫組化法：按照免疫組化染色試劑盒說明書的操作步驟檢測MAGE-A3、VEGF-A、CD34的表達，染色結(jié)果判斷：每例標本隨機計數(shù)5個高倍視野(×400)中陽性細胞所占百分比與計分。染色強度計分：O分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色，陽性細胞百分比計分：0分<5%、1分陽性細胞為<5%～25%、2分為26%～50%、3分為51%～75%、4分為>76%。用染色強度得分和陽性細胞數(shù)得分的乘積作為判斷表達結(jié)果，若積分≤1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～6分中陽性，≥7分為強陽性，每個樣本的最終分數(shù)(范圍為0～12分)。MAGE-A3/VEGF-A 主要表達于細胞質(zhì)，微血管密度(microvessel density, MVD)采用血管內(nèi)皮標記物CD34，定位于細胞膜染色呈棕黃色為陽性，按Weidner法進行微血管計數(shù)[5]。

3 LV3-MAGE-A3 RNAi慢病毒干擾載體感染H1299細胞 ：LV3-MAGE-A3(PGLVH1/GFP+Puro)是shRNA慢病毒即用表達系統(tǒng)，取濃縮純化病毒液，測定滴度為1×108TU/mL。用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)H1299細胞并種6孔板(1.5×106個/孔)，置于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中。待細胞生長融合至70%～80%左右時，按照MOI=20的感染復(fù)數(shù)稀釋LV3-MAGE-A3病毒原液和對照組LV3-NC病毒原液，滴加入孔，補培養(yǎng)基至1.2mL，37℃、5% CO2過夜培養(yǎng)。12 h后移除培養(yǎng)液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，感染48h TRIzol法提取細胞總RNA， 按照Tiangen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按SYBR Green試劑盒說明書操作，兩步法擴增MAGE-A3基因。MAGE-A3 上游引物5′-TGGAGGACCAGAGGCCCCC-3′， 下游引物 5′-GGACGATATCACGAGGCCTGC-3′；以GAPDH基因為內(nèi)參，獲得的Ct值進行基因相對定量， 2-△△ct法比較表達量，實驗重復(fù)3次，采用 real time qPCR 鑒定MAGE-A3的干擾效率。

4 Western Blot檢測：提取感染了LV3-MAGE-A3或LV3-NC的H1299細胞總蛋白，BCA蛋白定量后，取10μg蛋白/孔上樣，進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜， 5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h后，分別加入一抗：MAGE-A3，VEGF-A，MVD及內(nèi)參GAPDH(1 ∶5000稀釋)，4℃低速搖晃孵育過夜，TBST洗3遍，5 mim/次，加入對應(yīng)的HRP偶聯(lián)的二抗(1 ∶5000)于室溫孵育1h，TBST洗3遍，5 mim/次，ECL顯影。

5 MAGE-A3表達對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響：增殖實驗：將感染了LV3-MAGE-A3或LV3-NC的H1299細胞分別接種至96孔板(約5×103個/孔)，分別選取細胞接種后12 h、24 h、36 h 3個時間點檢測細胞活力。吸掉上清液，每孔加入20 μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5% MTT)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸掉上清，每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 mim，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標儀檢測波長490 nm的各孔光密度值，測定3個復(fù)孔取平均值，同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO)，實驗重復(fù)3次。

遷移實驗：將感染了LV3-MAGE-A3或LV3-NC的H1299細胞用無血清培養(yǎng)基重懸后加入Transwell 小室(8 μm 孔徑、 6.5 mm直徑)上室中(5×104個/孔，100μL體積)，下室加入600μL含10%小牛血清的1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后取出，棄液后PBS沖洗，用棉簽輕拭擦去上室未遷移細胞，加入4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色20 mim后PBS沖洗待鏡下觀察。

侵襲實驗：基本同遷移實驗，接種細胞前使用Matrigel基質(zhì)膠包被transwell上室，預(yù)冷保存12 h后，各取上述2組5×104個細胞接種至上室培養(yǎng)36 h后染色并固定細胞，步驟同遷移實驗。采用高倍顯微鏡隨機選取8個視野計數(shù)，取均值，每組各設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

三、 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較采用χ2卡方檢驗；采用spearman相關(guān)分析MAGE-A3 / VEGF-A在NSCLC組織中表達水平相關(guān)性；采用Kplan-Meier法分析NSCLC組織中MAGE-A3 / VEGF-A表達水平與預(yù)后的關(guān)系，用log-rank進行生存曲線顯著性檢驗，P<0.05為差異性有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MAGE-A3與VEGF-A在145例NSCLC組織中的表達陽性率分別為41.38%(60/145)和58.62%(85/145)；在本項研究中，MVD平均數(shù)值為36.7， ≥37為陽性，<37為陰性，表達陽性率63.45%(92/145)，MAGE-A3與VEGF-A表達陽性率比較 (χ2=1.533，P=0.232)，與MVD表達陽性率比較(χ2=1.894，P=0.115)，差異性均無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)(表1，圖1)。

表1 MAGE-A3與VEGF-A、MVD在NSCLC組織中表達陽性率比較[n(%)]

圖1 S-P免疫組化檢測NSCLC組織中MAGE-A3、VEGF-A與MVD表達(×400)

二、 根據(jù)MAGE-A3與VEGF-A在NSCLC中的共表達，將所有患者分為 4 組(表 2)。(M+V+)組：MAGE-A3和VEGF-A均表達陽性27.59%(40/145)，(M+V-)組：MAGE-A3表達陽性和VEGF-A表達陰性13.79%(20/145)，(M-V+)組：MAGE-A3表達陰性和VEGF-A表達陽性33.10%(48/145)，(M-V-)組：MAGE-A3和VEGF-A均表達陰性25.52%(37/145)。與M-V-組相比，M+V+組、M+V-組的鱗癌表達陽性率高、腫瘤體積大、分化程度較低、TNM分期晚和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性，均有顯著差異性(P<0.05)。

表2 MAGE-A3與VEGF-A在NSCLC中的共表達與臨床特征的關(guān)系[n(%)]

三、 MAGE-A3與VEGF-A在NSCLC組織中的表達水平

兩者之間呈正相關(guān)(r=0.519；P<0.001；圖2A)。MVD計數(shù)在MAGE-A3陽性組高于陰性組(41.14±1.87 vs.36.87±1.80；P<0.001)，結(jié)果相似，VEGF-A陽性組高于陰性組(40.26±2.20 vs.36.09±1.41；P<0.001)。MVD計數(shù)與MAGE-A3/VEGF-A共表達之間的相關(guān)性，M+V+組的為39.42±2.36，M+V-組為36.80±1.57，M-V+組為40.96±1.80，M-V-組為35.71±1.17，均與M-V-組MVD計數(shù)量相比，M+V+組(P<0.001)，M+V-組(P=0.011)均增高有統(tǒng)計學(xué)差異性，兩兩組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異性(P>0.05)(圖2B)。

圖2 NSCLC組織中MAGE-A3與VEGF-A表達水平正相關(guān)(A)，MVD計數(shù)在M+V+， M+V-， M-V+與M-V-組間比較(B)

四、LV3-MAGE-A3組干擾處理后，H1299細胞中MAGE-A3基因表達明顯下調(diào)(圖3A)；MAGE-A3、VEGF-A與MVD蛋白表達降低(P<0.05)(圖3B)。

圖3 干擾H1299細胞中MAGE-A3基因表達,MAGE-A3、VEGF-A與MVD蛋白表達降低注：與LV3-NC 組比較：LV3-MAGE-A3組(**P<0.05或*P<0.05)

五、 干擾H1299細胞的MAGE-A3基因表達, 12h后LV3-MAGE-A3組細胞增殖速率降低，36 h 后LV3-MAGE-A3組(3.27 ± 0.50)比LV3-NC 組(1.78 ±0.24)的OD 值明顯降低(P<0.05)(圖4A)；兩組細胞遷移細胞數(shù)分別為(103.40±7.86)個和(51.60±4.35)個(P<0.05)(圖4B)，侵襲細胞數(shù)分別為(81.40±6.82)個和(41.80±7.16)個(P<0.05)(圖4C)。

圖4 干擾MAGE-A3表達降低H1299細胞的增值、遷移和侵襲能力降低(×400，*P<0.05)

六、MAGE-A3 / VEGF-A在NSCLC中的表達與OS比較，差異性有統(tǒng)計學(xué)意義。MAGE-A3表達陽性比陰性短(20.9月vs 24.5月，P=0.0037)(圖5A)，VEGF-A表達陽性比陰性短(19.6月vs 26.7月，P<0.0001)(圖5B)，MAGE-A3 / VEGF-A共表達亞組分析比較，M+V+組 / M+V-組 / M-V+組，均短于M-V-組(16.8月 vs 22.1月 vs 20.9月 vs 28.4月，P<0.0001)(圖5C)。

圖5 MAGE-A3、VEGF-A在NSCLC組織中表達與OS比較

討 論

近年來，由于腫瘤治療的抗血管生成化合物的開發(fā)，增加了腫瘤血管生成評估的重要性[3]?？寡苌缮锼幬锏牡谝粋€也是最重要的治療靶點是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，它刺激內(nèi)皮細胞的增殖和運動，從而促進新血管的生長。VEGF-A是VEGF家族的各種成員最重要的血管生成介導(dǎo)因子，具有VEGFR-1(Flt-1)與 VEGFR-2(KDR/Flk-1)兩種受體，其中VEGFR-1作為的主要受體 ，與其結(jié)合促進腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程的發(fā)生。越來越多的證據(jù)表明，非編碼RNA通過參與NSCLC中VEGF-A的調(diào)節(jié)，而介導(dǎo)腫瘤血管生成和腫瘤的進展[6-7]。黑色素瘤抗原(Melanoma-associated antigen gene , MAGE)是一種原癌抗原，是癌睪丸抗原家族成員之一，MAGE-A 亞家族具有在正常組織中均不表達(除睪丸生殖細胞與胎盤滋養(yǎng)組織)，而在腫瘤組織中存在高表達成為了焦點。MAGE-A基因表達與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，在肺鱗狀細胞癌中表達更為常見；此外，它是NSCLC患者的獨立預(yù)后因素[8]。MAGE-A3是MAGE-A1～15多個亞類成員之一，其表達陽性率與研究的人群，標本種類及方法各不同，在臺灣地區(qū)肺腺癌3.3%，肺鱗癌29.8 %，與EGFR突變狀態(tài)未有相關(guān)性[9]。臨床分期也影響MAGE-A3表達，在手術(shù)臨床分期I或Ⅱ期NSCLC患者表達陽性率，Ⅰ～Ⅱ期的表達39.2%，其中I期29.5%、Ⅱ期 49.5%[10]。

MAGE-A3/4在NSCLC患者中表達44.4%，在鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)更高的表達率(P<0.001)，并且在 MAGE-A3 表達陽性的腫瘤中觀察到顯著更高的腫瘤壞死量(P=0.001)，MAGE-A3/4表達可能是影響 NSCLC 患者的預(yù)后因素[11]。來自大型前瞻性研究的數(shù)據(jù)分析MAGE-A3在IB、Ⅱ 或 ⅢA 期病理組織中表達陽性是NSCLC患者無病生存的重要影響因素[10]。也有報道稱MAGE-C2在NSCLC細胞中高表達，促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達，增強VEGF分泌，促進血管生成[12]?；谏鲜鰯?shù)據(jù)， MAGE-A3和VEGF-A可能在腫瘤進展和血管生成中扮演重要角色。它們表達之間的相關(guān)性和對于血管生成、預(yù)后是否有意義，從未被評估過。

血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的先決條件，MVD是用CD34標記腫瘤血管，可反映腫瘤血管生成的數(shù)量與血管生成情況，是判斷血管生成的“金標準”；也可作為NSCLC獨立預(yù)后的重要指標[13-14]。VEGF-A被確定為一種有效的促血管生成因子，在多種類型的人類腫瘤中均有表達，包括在食道癌基質(zhì)單核細胞中表達與MVD顯著相關(guān)(P=0.04)[15]；MACC-1 通過激活 TWIST1/VEGF-A 信號通路促進胃癌內(nèi)皮依賴性血管生成[16]； LRIG2表達下調(diào)通過EGFR/VEGF-A途徑抑制膠質(zhì)瘤血管生成[17]。MAGE-A3在NSCLC表達與血管生成相關(guān)研究，國內(nèi)外報道較少，僅作為一種良好特異性免疫抗原，以腺病毒介導(dǎo)的鈣網(wǎng)蛋白 (CALR) 和 MAGE-A3 遞送抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞系 U87 的侵襲和血管生成發(fā)揮抗癌作用，Ad-CALR/MAGE-A3 減少基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9表達，減弱膠質(zhì)母細胞瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力，抑制血管生成[18]。本研究中，MAGE-A3、VEGF-A與MVD在NSCLC中高表達，無統(tǒng)計學(xué)差異性，MAGE-A3與VEGF-A呈正相關(guān)性，且MAGE-A3表達的陽性亞組中MVD陽性率較高，證實與腫瘤血管生成相關(guān)性。在體外，通過慢病毒干擾LV3-MAGE-A3載體抑制H1299細胞株中MAGE-A3基因的表達后，細胞的遷移、侵襲及促血管形成能力均顯著降低，表明可能存在通過VEGF-A/VEGFR信號通路，靶向調(diào)控VEGF-A誘導(dǎo)血管生成作用機制。同時，MAGE-A3 在肺鱗癌中表達較高，具有低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期晚及預(yù)后差的特點，可為臨床治療策略選擇提供依據(jù)。

總之，MAGE-A3在NSCLC中表達具有促血管生成和侵襲、增殖作用，通過檢測NSCLC患者組織中MAGE-A3表達，提示抗血管治療重要性，也可以作為評估臨床療效指標。