韓敬，顧津伊，聶君旭，張艷萍，趙玲華

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病較嚴(yán)重和致命的并發(fā)癥之一。DN早期以腎臟肥大為主要病理特征，隨著病情進(jìn)展，其可導(dǎo)致腎小球細(xì)胞外基質(zhì)沉積和腎小管間質(zhì)纖維化，最終發(fā)展為不可逆腎結(jié)構(gòu)性損傷，引起終末期腎?。?］。2009—2012年我國(guó)2型糖尿病患者中DN的患病率為30%～50%，已超越腎小球腎病成為我國(guó)慢性腎病的首要原因［2-4］。DN早期癥狀隱匿，若不及時(shí)發(fā)現(xiàn)往往延誤治療時(shí)機(jī)，探尋DN相關(guān)生物標(biāo)志物，早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵［5］。腎纖維化是腎臟功能衰退的主要病理基礎(chǔ)，過度炎癥反應(yīng)可促使成纖維細(xì)胞增殖和過量基質(zhì)蛋白積累，導(dǎo)致腎功能進(jìn)行性下降，最終引發(fā)腎功能衰竭［6］。微小RNA（miRNAs）是一種單鏈非編碼RNA，通過抑制或降解mRNA，從而調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，miRNAs已被證實(shí)在腎纖維化的發(fā)展中起重要作用［7］。有研究顯示，在心房顫動(dòng)大鼠模型中，通過誘導(dǎo)miR-27b-3p過表達(dá)，可靶向抑制Wnt3a表達(dá)，繼而抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，抑制心肌細(xì)胞纖維化［8］。生物信息學(xué)分析表明，miR-342-3p在DN中表達(dá)下調(diào)，可能參與腎小管上皮細(xì)胞凋亡、腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的累積和纖維化進(jìn)程［9］。目前，miR-27b-3p、miR-342-3p是否與DN有關(guān)尚不明確。本研究旨在探討DN患者血清miR-27b-3p、miR-342-3p表達(dá)水平與DN的關(guān)系，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2018年1月—2021年12月云南大學(xué)附屬醫(yī)院收治的2型糖尿病患者157例，診斷符合2017版《中國(guó)2型糖尿病防治指南》。排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性腎臟疾病、腎先天畸形；伴惡性腫瘤、自身免疫疾病及急慢性感染性疾??；伴肺纖維化、肝纖維化、縱隔纖維化等纖維化疾病。根據(jù)患者尿白蛋白與肌酐比率（UACR）［10］將患者分為正常白蛋白尿（UACR＜30 mg/g，NA）組49例、微量白蛋白尿（30 mg/g≤UACR＜299 mg/g，MA）組41例、大量白蛋白尿（UACR≥300 mg/g，DN）組67例。3組年齡、性別構(gòu)成及體質(zhì)量指數(shù)（BMI）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性，見表1。本研究已經(jīng)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：PZ-180212），患者或家屬均簽署知情同意書。

Tab.1 Comparison of baseline data between the three groups表1 3組基線資料比較

1.2研究方法

1.2.1一般資料收集收集受試者年齡，性別，BMI，吸煙史（煙齡20 a，吸煙量≥20包/a），合并疾?。ǜ哐獕骸⒏咧Y、冠心病、腦梗死），2型糖尿病病程，2型糖尿病家族史，是否合并視網(wǎng)膜病變，是否合并非酒精性脂肪肝，入院時(shí)收縮壓和舒張壓，降糖治療用藥情況（口服降糖藥物、胰島素皮下注射、口服降糖和胰島素皮下注射聯(lián)合用藥）等。

1.2.2實(shí)驗(yàn)室檢查2型糖尿病患者入院24 h內(nèi)采集肘正中靜脈血3 mL和尿液完善實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查。采用Spectra-Max?iD5多功能酶標(biāo)儀（上海美谷分子儀器有限公司）以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)尿液中Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原肽（PCⅢ）水平，試劑盒購(gòu)自奧維亞生物技術(shù)有限公司。參照劉旭輝等［11］方法采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miR-27b-3p、miR-342-3p。引物序列miR-27b-3p：上游5′-AGTGGCTAAGTTCTGCTCTCAAC-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′；miR-342-3p：上游5′-ACACTCCAGCTGGGAGGGGGTGCTATCTGTGAT-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6（內(nèi)參）：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。東芝40型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），根據(jù)CKD-EPI公式估算腎小球?yàn)V過率（eGFR）。放射免疫法（儀器為GC-1200 γ放射免疫計(jì)數(shù)器）檢測(cè)尿微量白蛋白。美國(guó)強(qiáng)生穩(wěn)定倍加型血糖儀檢測(cè)末梢血空腹血糖（FPG），放射免疫法（日立h7060全自動(dòng)化學(xué)免疫分析儀）檢測(cè)空腹胰島素（FINS）。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=（FPG×FINS）/22.5，HA8160糖化血紅蛋白分析儀檢測(cè)糖化血紅蛋白（HbA1c）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.00和MedCalc 19.0.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，偏態(tài)分布經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后使其符合正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。計(jì)數(shù)資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，組間多重比較采用校正χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。采用多因素Logistic回歸分析危險(xiǎn)因素。繪制受試者工作特征（ROC）曲線進(jìn)行診斷效能分析，采用Delong test檢驗(yàn)計(jì)算曲線下面積差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較3組吸煙史、高脂血癥、冠心病、腦梗死、2型糖尿病家族史、舒張壓、降糖治療比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NA組比較，DN組和MA組2型糖尿病病程、收縮壓均增加（P＜0.05），DN組高血壓、合并視網(wǎng)膜病變、合并非酒精性脂肪肝比例增加（P＜0.05）。與MA組比較，DN組高血壓、2型糖尿病病程、合并視網(wǎng)膜病變、合并非酒精性脂肪肝比例、收縮壓均增加（P＜0.05），見表2。

2.2 3組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較與NA組比較，MA組和DN組HbA1c、UACR、尿Ⅳ-C、尿LN、尿PCⅢ水平均增加，而miR-27b-3p、miR-342-3p表達(dá)均降低（P＜0.05），DN組BUN、Scr水平增加，而eGFR水平降低（P＜0.05）。與MA組比較，DN組HbA1c、BUN、Scr、UACR以及尿Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平均增加，而eGFR和miR-27b-3p、miR-342-3p表 達(dá) 均 降 低（P＜0.05），見表3。

2.3 影響DN的Logistic回歸分析結(jié)果以是否患DN（否=0，是=1）因變量，以高血壓（否=0，是=1）、2型糖尿病病程、視網(wǎng)膜病變（否=0，是=1）、非酒精性脂肪肝（否=0，是=1）、HbA1c、miR-27b-3p、miR-342-3p、收縮壓、UACR、BUN、Scr、尿Ⅳ-C、尿LN、尿PCⅢ，eGFR為自變量。單因素Logistic回歸結(jié)果顯示，高血壓、HbA1c、尿PCⅢ、eGFR、miR-27b-3p、miR-342-3p是DN發(fā)生的影響因素（P＜0.05），見表4。將單因素Logistic回歸中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素Logistic回歸方程，采用逐步后退法選擇和剔除變量，結(jié)果顯示，較高水平的尿PCⅢ是DN的危險(xiǎn)因素，而較高水平的miR-27b-3p、miR-342-3p、eGFR是保護(hù)因素（P＜0.05），見表5。

2.4 相關(guān)性分析DN組miR-27b-3p、miR-342-3p表達(dá)與eGFR呈正相關(guān)（r分別為0.647、0.661，P＜0.05），與尿PCⅢ呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.739、-0.766，P＜0.05）。

Tab.2 Comparison of baseline data and laboratory indicators between the three groups表2各組一般資料比較

Tab.3 Comparison of laboratory indicators between the three groups表3各組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 （±s）

Tab.3 Comparison of laboratory indicators between the three groups表3各組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與NA組比較，b與MA組比較，P＜0.05。

組別NA組MA組DN組F n 49 41 67 TC（mmol/L）5.19±1.42 5.21±1.53 5.28±1.55 0.276 TG（mmol/L）1.75±0.20 1.76±0.21 1.80±0.25 0.537 LDL-C（mmol/L）3.57±0.55 3.59±0.51 3.62±0.65 0.317 FPG（mmol/L）7.90±1.30 7.93±1.31 8.42±1.35 2.765 FINS（U/mL）8.79±1.83 8.82±1.93 9.05±2.33 1.805 HbA1c（%）5.02±1.21 6.12±1.34a 8.85±1.79ab 77.594＊＊HOMA-IR 3.08±0.59 3.11±0.97 3.39±1.08 2.861 BUN（mmol/L）5.65±1.35 6.12±1.09 35.26±6.32ab 1 044.950＊＊Scr（μmol/L）84.98±16.97 85.35±16.53 186.43±21.52ab 555.002＊＊組別NA組MA組DN組F UACR（mg/g）16.35±3.53 103.47±26.23a 369.02±41.42ab 839.418＊＊eGFR［mL/（min·1.73m2）］113.05±13.42 112.32±13.26 82.35±6.43ab 145.616＊＊Ⅳ-C（μg/L）72.02±12.72 80.12±15.32a 201.32±30.07ab 707.673＊＊LN（μg/L）64.95±13.08 71.50±16.09a 136.26±28.65ab 149.726＊＊PCⅢ（μg/L）44.02±10.27 49.53±11.02a 163.26±21.18ab 921.650＊＊miR-27b-3p（2-ΔΔCt）3.10±0.69 2.29±0.55a 1.02±0.35ab 166.444＊＊miR-342-3p（2-ΔΔCt）2.81±0.52 2.01±0.34 0.95±0.28ab 249.438＊＊

Tab.4 Univariate Logistic regression analysis of factors affecting the incidence of DN表4影響DN的單因素Logistic回歸分析

Tab.5 Multivariate Logistic regression analysis of factors affecting the incidence of DN表5影響DN的多因素Logistic回歸分析

2.5 各指標(biāo)診斷DN效能分析基于前述Logistic回歸結(jié)果，建立聯(lián)合診斷回歸預(yù)測(cè)模型，Log［P/（1-P）］=15.087+0.502×尿PCⅢ-0.842×eGFR-0.559×miR-27b-3p-0.416×miR-342-3p，擬合ROC曲線顯示聯(lián)合診斷DN的AUC為0.948，聯(lián)合檢測(cè)效能高于單獨(dú)eGFR、尿PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p（Z分別 為5.631、5.794、6.715、4.577，P＜0.05），見 圖1、表6。

Fig.1 ROC graphs of eGFR,PCⅢ,miR-27b-3p and miR-342-3p for diagnosing DN圖1 eGFR、尿PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p診斷DN的ROC曲線

Tab.6 Efficacy of eGFR,PCⅢmiR-27b-3p and miR-342-3p in diagnosing DN表6 eGFR、尿PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p診斷DN的效能

3 討論

DN是導(dǎo)致糖尿病患者死亡和殘疾的主要原因。目前，DN診斷以UACR、eGFR為主要參考指標(biāo)，但是UACR、eGFR受感染、發(fā)熱、心力衰竭等因素影響較大，積極探尋新型DN相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物十分必要。目前，已發(fā)現(xiàn)DN患者血清和腎組織中部分miRNA異常表達(dá)，miRNA可能與DN發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，有望成為DN早期診斷的潛在標(biāo)志物［12］。miR-27b-3p是與組織纖維化密切相關(guān)的miRNA，位于人類19號(hào)染色體，在乳腺、肝臟、腎臟等多種器官中廣泛表達(dá)，miR-27b-3p通過靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β受體1、Smad等纖維化相關(guān)基因表達(dá)，從而參與成纖維細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)過程，其與多種纖維化相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)［13］。研究顯示，miR-27b在心肌纖維化患者和大鼠梗死心臟組織中表達(dá)水平均增加，miR-27b過表達(dá)通過抑制含F(xiàn)框及WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白7介導(dǎo)的Snail降解，促使膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和纖維化［14］。miR-27b-3p同樣參與視網(wǎng)膜下纖維化進(jìn)程，miR-27b-3p表達(dá)增加可通過靶向調(diào)控HOXC6基因，阻斷TGF-β/Smad信號(hào)通路激活，抑制EMT和視網(wǎng)膜纖維化［15］。miR-27b-3p還 通 過 直 接 靶 向TGF-β受 體1和SMAD2，抑制肺組織成纖維細(xì)胞活化［13］。本研究結(jié)果顯示，DN組、MA組患者血清miR-27b-3p表達(dá)較NA組下調(diào)，且miR-27b-3p表達(dá)與eGFR呈正相關(guān)，與尿PCⅢ呈負(fù)相關(guān)，表明miR-27b-3p表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致腎纖維化和腎功能損傷，提示miR-27b-3p可抑制腎纖維化和2型糖尿病患者DN進(jìn)程，機(jī)制可能為miR-27b-3p表達(dá)下調(diào)而導(dǎo)致其抗纖維化作用減弱，促使肌成纖維細(xì)胞活化和增殖，腎小管上皮細(xì)胞凋亡及上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)過度積聚，最終導(dǎo)致腎纖維化和DN的發(fā)生。體外實(shí)驗(yàn)亦顯示，miR-27b-3p通過結(jié)合信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）的3′-UTR并下調(diào)STAT1表達(dá)，從而抑制α-平滑肌激動(dòng)蛋白、Ⅲ型膠原蛋白和纖維連接蛋白表達(dá)，減輕腎纖維化［16］。

miR-342-3p定位于14q32，嵌入其宿主基因Ena/VASP like（EVL）的第三個(gè)內(nèi)含子中，與細(xì)胞外基質(zhì)沉積和TGF-β信號(hào)通路均關(guān)系密切［17］。miR-342-3p是Notch信號(hào)通路的下游分子，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的SMAD1/5磷酸化，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和TGF-β表達(dá)，參與血管生成和EMT［18］。另外，miR-342-3p還可負(fù)向調(diào)控Wnt3a表達(dá)，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡過程以及EMT調(diào)控過程［19］。TGF-β是腎纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)，主要通過激活其下游Smad信號(hào)通路來誘導(dǎo)α-平滑肌激動(dòng)蛋白、Ⅲ型膠原蛋白和纖連蛋白表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化，增強(qiáng)膠原合成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致腎纖維化形成［20］。EMT是肌成纖維細(xì)胞的主要來源，活化肌成纖維細(xì)胞可引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積，引起腎間質(zhì)纖維化［21］。由此推測(cè)，miR-342-3p可能與腎纖維化和腎臟疾病有關(guān)。本研究結(jié)果亦顯示，DN組、MA組患者血清miR-342-3p表達(dá)較NA組下調(diào)，證實(shí)了miR-342-3p低表達(dá)與腎纖維化和腎功能下降有關(guān)。推測(cè)miR-342-5p參與DN的機(jī)制為：首先，miR-342-5p可通過負(fù)向調(diào)控Ptch1表達(dá)，抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制腎纖維化進(jìn)程［22］；其次，miR-342-3p可靶向抑制SRY盒轉(zhuǎn)錄因子6表達(dá)，促進(jìn)腎系膜細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，抑制高糖誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化［23］。因此，miR-342-3p表達(dá)下調(diào)可能通過促使腎纖維化，從而導(dǎo)致腎功能損傷和DN發(fā)生。

miR-27b-3p、miR-342-3p在DN患者血清中的異常表達(dá)可用作DN輔助診斷的參考指標(biāo)。本研究ROC分析結(jié)果顯示，miR-27b-3p、miR-342-3p在糖尿病人群中鑒別DN的AUC為0.733、0.652，表明miR-27b-3p、miR-342-3p可鑒別DN的發(fā)生，但是單獨(dú)診斷敏感度和特異度均偏低，尚不能滿足診斷DN的需求，聯(lián)合eGFR、PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p指標(biāo)后AUC明顯擴(kuò)大，表明聯(lián)合miR-27b-3p、miR-342-3p、eGFR、PCⅢ檢測(cè)可提高DN的檢出率，為臨床診斷提供更可靠的參考。

綜上，DN、MA患者血清miR-27b-3p、miR-342-3p表達(dá)較NA患者均降低，miR-27b-3p、miR-342-3p低表達(dá)與腎功能下降、DN發(fā)生有關(guān)；miR-27b-3p、miR-342-3p表達(dá)下調(diào)可能通過加速腎纖維化，從而參與DN發(fā)病過程。因此，miR-27b-3p、miR-342-3p可作為DN輔助診斷的參考指標(biāo)。