閆春曉，李培越，鄭啟秘，鄒曉，李建波

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種以進(jìn)行性記憶受損、認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，其發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)在近幾年增長迅速，已成為全球性公共衛(wèi)生問題［1］。AD初期表現(xiàn)缺乏特異性，易被忽視，確診時(shí)多數(shù)患者已出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙等問題，通常無法進(jìn)行有效治療。因此，預(yù)防AD患者發(fā)生重度認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵措施是尋找到早期診斷標(biāo)志物。Apelin13屬于血管活性肽，由77個(gè)氨基酸殘基組成，其編碼基因位于染色體Xq25，在視網(wǎng)膜、心臟及大腦等組織中均有表達(dá)，參與調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)、血管生成、能量代謝及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等生理過程［2］。研究顯示，Apelin13能夠抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的異?；罨龠M(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）生成，維持神經(jīng)元活性，誘導(dǎo)微血管生成，緩解腦組織因缺血、缺氧所致的損傷［2］。FK506結(jié)合蛋白51（FK506 binding protein 51，F(xiàn)KBP5）屬于親免素蛋白家族，編碼基因定位于染色體6p21，通過結(jié)合特定的分子伴侶蛋白，調(diào)節(jié)類固醇激素受體活化、細(xì)胞核移位及蛋白質(zhì)折疊等生物學(xué)過程［3］。研究表明，F(xiàn)KBP5蛋白的FK506結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有異構(gòu)酶活性，能夠促進(jìn)激素-受體復(fù)合物形成，介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)抑郁癥的發(fā)生［3］。目前，Apelin13和FKBP5mRNA在AD中表達(dá)的相關(guān)研究少見，且兩者與認(rèn)知功能障礙的關(guān)系尚不清楚。本研究就此進(jìn)行探討。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2018年10月—2021年10月達(dá)州市中心醫(yī)院收治的AD患者（AD組）93例，符合《中國癡呆診療指南（2012版）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；男43例，女50例；年齡55～72歲，平均（64.33±9.02）歲；受教育程度：小學(xué)32例，初中44例，高中及以上17例；伴有糖尿病者45例，伴有高血壓者52例。納入標(biāo)準(zhǔn)：精神狀態(tài)穩(wěn)定，具有獨(dú)立完成相關(guān)量表評(píng)分的能力。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）由乙醇、感染、藥物、營養(yǎng)障礙及外傷所致的其他類型癡呆。（2）合并其他影響認(rèn)知功能的腦部疾病，如癲癇、帕金森病及腦炎等。（3）存在自殘傾向者。（4）伴有先天性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常者。（5）伴有重度視聽障礙，無法完成量表評(píng)分者。（6）合并惡性腫瘤，如膠質(zhì)瘤、肺癌、肝癌及前列腺癌。（7）心、肝、腎功能障礙者。（8）合并全身嚴(yán)重感染者。選取同期同年齡層來院體檢的健康者（對(duì)照組）90例，男46例，女44例；年齡56～71歲，平均（65.58±9.39）歲；受教育程度：小學(xué)28例、初中40例、高中及以上22例；伴有糖尿病者37例，伴有高血壓者41例。2組年齡（t=0.919）、性別（χ2=0.436）、受教育程度（χ2=1.050）、糖尿病史（χ2=0.980）及高血壓史（χ2=1.954）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：M201803-074），全部研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2主要儀器與試劑離心機(jī)購自美國Labnet公司（型號(hào)：SCI-12）。全自動(dòng)生化分析儀購自瑞士羅氏公司（型號(hào)：COBAS INTEGRA 800）。DynabeadsTMmRNA Purification Kit試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司（批號(hào)：20180926）。iScript cDNA Synthesis Kit購自Bio-Rad公 司（批 號(hào)：20180915）。SunShineBioTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR Detecting，qPCR）檢測系統(tǒng)Master Mix kit購自南京生興生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：20180921）。

1.3血清指標(biāo)測定研究對(duì)象均于空腹?fàn)顟B(tài)下采集肘正中靜脈血10 mL置于抗凝管中，離心機(jī)（4℃，離心半徑10 cm）6 000 r/min離心5 min，收集上清液，置于-80℃冰箱中保存。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中Apelin13、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein，LDL-C）水平。

1.4qPCR法檢測血清FKBP5mRNA表達(dá)水平采用DynabeadsTMmRNA Purification Kit提取AD患者血清中的總RNA。將提取的總RNA滴入20 μL無RNA酶的水中溶解，通過紫外分光光度儀計(jì)算RNA的純度和濃度。利用iScript cDNA Synthesis Kit將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件：42℃60 min，85℃15 min。通過SunShineBioTMqPCR Master Mix kit定量檢測FKBP5mRNA的表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：Taq PCR MasterMix 10 μL，cDNA樣本3 μL，dH2O 5 μL，上下游引物各1 μL。FKBP5引物：上游5′-TTTGACTGCAGAGATGTGGC-3′，下 游5′-CCTGCCTCTCCAAAACCATA-3′。GAPDH引物：上 游5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′，下游5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。引物序列由蘇州泓迅生物科技公司合成。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃20 s；變性95℃20 s，退火60℃30 s，延伸70℃5 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。以2-ΔΔCt法計(jì)算FKBP5mRNA的表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.5認(rèn)知功能障礙評(píng)估采用簡易精神狀態(tài)量表（minimental state examination，MMSE）［4］評(píng)估AD患者的認(rèn)知功能障礙，主要從瞬時(shí)記憶、短時(shí)記憶、視覺及空間感覺、定向力、注意力計(jì)算力及語言表達(dá)能力進(jìn)行評(píng)分?？偡?0分，其中正常為25～30分，輕度為20～24分、中度為10～19分、重度為＜10分。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0和Medcalc 15.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用2獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用Bonferroni法。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Pearson相關(guān)分析Apelin13、FKBP5mRNA與MMSE評(píng)分的相關(guān)性。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析Apelin13、FKBP5mRNA對(duì)AD患者發(fā)生重度認(rèn)知功能障礙的診斷價(jià)值。采用二元Logistic回歸構(gòu)建Apelin13、FKBP5mRNA聯(lián)合診斷模型，得到兩者聯(lián)合應(yīng)用的預(yù)測概率值，將生成的預(yù)測概率值作為新的診斷指標(biāo)進(jìn)行ROC曲線分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和AD組血清學(xué)指標(biāo)、FKBP5mRNA及MMSE評(píng)分比較2組血清LDL-C、TC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，AD組MMSE評(píng)分和血清中Apelin13水平降低，而血清中FKBP5mRNA水平升高（均P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of serum indicators,FKBP5 mRNA and MMSE score between the two groups表1 2組血清學(xué)指標(biāo)、FKBP5 mRNA及MMSE評(píng)分比較（±s）

Tab.1 Comparison of serum indicators,FKBP5 mRNA and MMSE score between the two groups表1 2組血清學(xué)指標(biāo)、FKBP5 mRNA及MMSE評(píng)分比較（±s）

＊＊P＜0.01。

組別對(duì)照組AD組t n 90 93 LDL-C（mmol/L）2.03±0.59 2.18±0.63 1.661 TC（mmol/L）3.78±1.06 4.04±1.17 1.574 Apelin13（μg/L）43.69±10.06 17.82±5.07 21.857＊＊FKBP5 mRNA 1.13±0.32 3.88±1.11 22.928＊＊MMSE評(píng)分（分）28.29±1.68 15.21±4.61 25.336＊＊

2.2 二元Logistic回歸模型分析AD的影響因素以是否發(fā)生AD為因變量（否=0，是=1），以MMSE評(píng)分、FKBP5mRNA及Apelin13為自變量，二元Logistic回歸分析顯示，較高的MMSE評(píng)分、Apelin13是AD發(fā)生的保護(hù)因素，而較高的FKBP5mRNA是AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Binary Logistic regression model analysis of influencing factors of AD表2 AD影響因素的二元Logistic回歸模型分析結(jié)果

2.3 不同程度認(rèn)知功能障礙AD患者血清中Apelin13和FKBP5mRNA的比較輕、中及重度組認(rèn)知功能障礙AD患者血清中Apelin13水平依次降低，而FKBP5mRNA水平依次升高（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of Apelin13 and FKBP5 mRNA between AD patients with different levels of cognitive impairment表3不同程度認(rèn)知功能障礙AD患者血清中Apelin13和FKBP5 mRNA的比較 （±s）

Tab.3 Comparison of Apelin13 and FKBP5 mRNA between AD patients with different levels of cognitive impairment表3不同程度認(rèn)知功能障礙AD患者血清中Apelin13和FKBP5 mRNA的比較 （±s）

類型輕度組中度組重度組F n 10 51 32 Apelin13（μg/L）25.62±6.91 18.92±5.03a 13.63±3.27ab 27.359＊＊FKBP5 mRNA 3.09±0.72 3.72±0.91a 4.38±0.96ab 9.373＊＊

＊＊P＜0.01；a與輕度組比較，b與中度組比較，P＜0.05。

2.4 AD患者血清中的Apelin13、FKBP5mRNA水平與MMSE評(píng)分的相關(guān)性AD患者M(jìn)MSE評(píng)分與血清FKBP5mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，而與Apelin13水平呈正相關(guān)（r分別為-0.706、0.722，均P＜0.05）。

2.5 血清Apelin13、FKBP5mRNA水平對(duì)AD患者重度認(rèn)知功能障礙的診斷價(jià)值以AD患者是否發(fā)生重度認(rèn)知功能障礙為因變量，以Apelin13和FKBP5mRNA為自變量，進(jìn)行兩者聯(lián)合診斷的二元Logistic回 歸 方 程 為logit（Y）=-3.623+0.358×（Apelin13）+2.137×（FKBP5mRNA）。結(jié)果顯示，相較于單一Apelin13或FKBP5mRNA指標(biāo)，Apelin13聯(lián)合FKBP5mRNA診斷重度認(rèn)知功能障礙的曲線下面積（AUC）、敏感度和特異度均較高，見圖1、表4。

Fig.1 Diagnostic values of serum Apelin13 and FKBP5 mRNA levels for severe cognitive impairment in AD patients圖1血清Apelin13、FKBP5 mRNA水平對(duì)AD患者重度認(rèn)知功能障礙的診斷價(jià)值

Tab.4 Diagnostic values of Apelin13 and FKBP5 mRNA for severe cognitive impairment表4 Apelin13、FKBP5 mRNA對(duì)重度認(rèn)知功能障礙的診斷價(jià)值

3 討論

AD是一種最常見的癡呆癥，約占癡呆患者總數(shù)的80%，2019年世界新增AD患者約3 600萬例［1］。AD的病理機(jī)制主要包括大腦質(zhì)量減低、體積縮小，腦回（以顳葉海馬區(qū)為主）萎縮，腦溝加深、變寬，神經(jīng)纖維纏結(jié)積聚等［5-6］。AD發(fā)病是多因素共同疊加所致，可能與血管病變、遺傳易感性、不良飲食習(xí)慣、受教育程度較低及激素水平異常有關(guān)。目前，臨床尚無有效手段治療AD，因此早期診斷、早期預(yù)防是治療AD的關(guān)鍵措施。

Apelin13是一種內(nèi)源性神經(jīng)肽，主要由脂肪細(xì)胞分泌，其血漿水平及活性在Apelin家族中均居首位，可通過結(jié)合內(nèi)源性受體血管緊張素Ⅱ1型受體相關(guān)蛋白（putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1，APJ）參與調(diào)控垂體釋放功能激素、進(jìn)食行為及學(xué)習(xí)記憶等過程［7］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在缺血再灌注大鼠模型中，Apelin13能夠降低血漿炎性因子和細(xì)胞因子水平，減少神經(jīng)功能缺損，縮小腦梗死體積［8］。Angelopouluo等［7］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)帕金森癥模型大鼠注射外源性Apelin13，可減輕其認(rèn)知功能障礙，加快大鼠腦組織中尼氏體合成速度。本研究結(jié)果顯示，AD組患者血清中Apelin13水平較對(duì)照組降低，提示Apelin13可能參與AD的起病過程，考慮原因是AD患者Apelin13的編碼基因APLN沉默，無法完成轉(zhuǎn)錄翻譯過程，使Apelin13合成減少，血清中Apelin13水平降低［7］。本研究結(jié)果顯示，隨著認(rèn)知功能障礙的加重，AD患者血清中Apelin13水平逐漸降低，提示Apelin13可能在AD進(jìn)展過程中具有保護(hù)作用，其原因可能是Apelin13失活能夠降低促凋亡蛋白（B-cell lymphoma-2，bcl2）/bcl2相關(guān)X蛋白（bcl2-Associated X protein，bax）比值，增強(qiáng)半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）活性，促進(jìn)受體寡聚和適配蛋白募集，誘導(dǎo)海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，加重了認(rèn)知功能障礙［9］。此外，Apelin13活性降低可阻礙APJ信號(hào)通路傳導(dǎo)，抑制下游蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1和IL-6合成，破壞腦功能區(qū)的神經(jīng)前體細(xì)胞，并抑制神經(jīng)元分化，使腦內(nèi)神經(jīng)功能受損［10］。

FKBP5是一種FK506結(jié)合蛋白，分子質(zhì)量約為51 ku，存在于細(xì)胞核中，在前額皮質(zhì)、杏仁核及海馬體中廣泛表達(dá)，通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenocortical，HPA）軸，在應(yīng)激反應(yīng)和代謝效應(yīng)中發(fā)揮重要作用［11］。研究表明，F(xiàn)KBP5mRNA能夠延長HPA軸負(fù)反饋的反應(yīng)時(shí)間，導(dǎo)致皮質(zhì)醇類激素對(duì)壓力刺激的反應(yīng)敏感度降低，提高精神分裂癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［12］。Willi等［11］發(fā)現(xiàn)，與野生型斑馬魚相比，注射FKBP5mRNA的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的脊髓初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突修復(fù)和重建能力均降低，而在注射FKBP5mRNA拮抗劑后軸突修復(fù)能力顯著上升。本研究結(jié)果表明，AD組患者血清中FKBP5mRNA水平較對(duì)照組升高，提示血清FKBP5mRNA水平的高低可能與AD發(fā)病有關(guān)。其機(jī)制可能是FKBP5基因的CpG位點(diǎn)發(fā)生去甲基化，誘導(dǎo)增強(qiáng)子活化并結(jié)合RNA聚合酶，加速轉(zhuǎn)錄翻譯過程，促進(jìn)FKBP5mRNA合成并釋放入血，導(dǎo)致血清中FKBP5mRNA表達(dá)水平升高［12］。隨著認(rèn)知功能障礙的加重，AD患者血清中FKBP5mRNA水平逐漸升高，提示FKBP5mRNA可能對(duì)AD的進(jìn)展具有調(diào)控作用。其原因可能是FKBP5mRNA通過激活熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90），誘導(dǎo)海馬、杏仁核等區(qū)域Tau蛋白過度磷酸化，促進(jìn)鈣蛋白酶合成，介導(dǎo)突觸后Ca2+持續(xù)內(nèi)流，使神經(jīng)元持續(xù)異常興奮，加速神經(jīng)元凋亡，誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙發(fā)生［13］。此外，F(xiàn)KBP5mRNA異?；罨軌蛞种铺瞧べ|(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）表達(dá)，對(duì)HPA軸負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，使HPA軸功能異常，導(dǎo)致海馬內(nèi)大量神經(jīng)元再生減少和神經(jīng)元退行性變，海馬功能受損，認(rèn)知功能明顯下降［14］。

二元Logistic回歸分析顯示，較高的MMSE評(píng)分、Apelin13是AD發(fā)生的保護(hù)因素，而較高的FKBP5mRNA是AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示MMSE評(píng)分、血清FKBP5mRNA、Apelin13水平可能成為篩查AD的潛在指標(biāo)。另外，本研究結(jié)果顯示，AD患者M(jìn)MSE評(píng)分與血清FKBP5mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，而與Apelin13水平呈正相關(guān)，亦進(jìn)一步證實(shí)血清Apelin13、FKBP5mRNA水平與認(rèn)知功能障礙具有相關(guān)性，2個(gè)指標(biāo)在定量評(píng)估認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度方面具有潛在價(jià)值。其原因可能是Apelin13活性被抑制后使線粒體功能發(fā)生障礙，抑制了線粒體酶復(fù)合物合成，活性氧（reactive oxygen，ROS）和自由基產(chǎn)生增多，激活了糖原合成酶激酶3（GSK-3），誘導(dǎo)β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）積聚，使大腦皮層內(nèi)神經(jīng)纖維絲纏結(jié)，導(dǎo)致神經(jīng)認(rèn)知和記憶功能受損［15］。FKBP5mRNA異常活化能夠促進(jìn)Tau蛋白磷酸化，使Tau蛋白活化，活化的Tau蛋白無法與神經(jīng)纖維內(nèi)的微管蛋白結(jié)合，導(dǎo)致微管結(jié)構(gòu)解聚，軸突信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)功能喪失，突觸逐漸萎縮，神經(jīng)元失活，加重了認(rèn)知障礙程度［13-14］。此外，F(xiàn)KBP5mRNA能夠抑制磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/AKT信號(hào)通路，阻礙Apelin13合成，從而加劇Aβ蛋白積聚，誘導(dǎo)神經(jīng)元變性，突觸軸突受損，影響神經(jīng)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，損傷認(rèn)知功能［10，16］。ROC曲線顯示，Apelin13聯(lián)合FKBP5mRNA的AUC值明顯高于單一Apelin13或FKBP5mRNA，提 示Apelin13聯(lián) 合FKBP5mRNA能夠提高對(duì)AD患者重度認(rèn)知功能障礙的診斷價(jià)值，同時(shí)，較高的敏感度有利于早期篩查可能發(fā)生重度認(rèn)知功能障礙的AD患者，為早期臨床防治提供可靠支持。

綜上所述，AD患者血清中Apelin13水平降低，而FKBP5mRNA水平升高。同時(shí)，血清中Apelin13、FKBP5mRNA水平能夠反映AD患者的認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度。Apelin13聯(lián)合FKBP5mRNA對(duì)AD患者重度認(rèn)知功能障礙具有良好的診斷效能，且敏感度較高，有助于臨床實(shí)施早期干預(yù)，但血清中Apelin13和FKBP5mRNA變化的具體機(jī)制尚不清楚，需要在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。