林海鵬，黨旭紅，左雅慧

放射性皮膚損傷是由X、γ或β射線外照射引起的皮膚損傷，也是一種放射性職業(yè)病。在核燃料循環(huán)領(lǐng)域，如乏燃料后處理廠事故情況下，料液泄露可能導(dǎo)致皮膚沾污而引發(fā)放射性皮膚損傷；放射性皮炎是腫瘤放射治療最常見的并發(fā)癥。輻射損傷與一般熱力燒傷不同，臨床表現(xiàn)為發(fā)病緩慢、病程長、臨床分期明顯、全身反應(yīng)重；深度放射性損傷創(chuàng)面反復(fù)破潰，經(jīng)久不愈甚至惡變，是典型的難愈性傷口。皮膚成纖維細(xì)胞是參與創(chuàng)面修復(fù)的主要細(xì)胞，其功能正常與否直接影響創(chuàng)面肉芽組織生成和創(chuàng)面愈合［1］。放射性皮膚損傷進(jìn)程中，輻射誘發(fā)皮膚成纖維細(xì)胞功能改變的研究對于損傷救治具有重要意義。神經(jīng)肽P物質(zhì)（SP）是由11個氨基酸組成的多肽，屬于速激肽家族［2］。SP作為神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用。外源SP可以刺激傷口表面成纖維細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)血管生成因子和膠原纖維的合成和分泌，在傷口愈合和瘢痕增生中發(fā)揮重要作用［3］。本研究旨在探討外源性SP對放射損傷皮膚成纖維細(xì)胞分泌功能及細(xì)胞因子表達(dá)的影響，以期為放射性皮膚損傷救治提供參考。

1 材料與方法

1.1材料人皮膚成纖維細(xì)胞HFF-1購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。SP（Sigma-Aldrich公司，美國）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（Biological Industries，以色列）；胰蛋白酶［生工生物工程（上海）股份有限公司，中國］；二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司，美國）；RNAsimple總RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，中國］；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（寶生物工程有限公司，大連）；Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒［安迪生物科技（上海）有限公司，上海］；Rotor-Gene 6000熒光定量PCR儀（Corbett Life Science公司，澳大利亞）。

Tab.1 Design of real-time fluorescence quantitative PCR primers表1實時熒光定量PCR引物設(shè)計

1.2研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)HFF-1細(xì)胞至對數(shù)生長期。取對數(shù)生長期的HFF-1細(xì)胞分組傳代培養(yǎng)。細(xì)胞分為未照射組（0 Gy），照射組（2 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy），SP干預(yù)組（0 Gy+SP、2 Gy+SP、6 Gy+SP、12 Gy+SP、18 Gy+SP）。各實驗組細(xì)胞傳代培養(yǎng)，待貼壁生長后，于照射前12 h更換為含有0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基。照射前1 h，向SP干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入SP水溶液，SP終濃度為1×10-7mol/L。

1.2.2細(xì)胞照射在冰浴下用醫(yī)用直線加速器產(chǎn)生的4 MeV電子束照射細(xì)胞，吸收劑量率為4 Gy/min，源距100 cm，照射野為20 cm×20 cm。照射劑量分別為0、2、6、12和18 Gy。

1.2.3人皮膚成纖維細(xì)胞分泌功能的檢測于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種HFF-1細(xì)胞，照射后24 h分別收集各實驗組細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞，參照ELISA試劑盒說明書，分別測定各組培養(yǎng)基及細(xì)胞裂解液中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及CGRP表達(dá)量。

1.2.4ELISA法檢測人皮膚成纖維細(xì)胞中VEGF、bFGF、PDGF蛋白表達(dá)水平于照射后24 h，2 000 r/min離心10 min收集各實驗組細(xì)胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后超聲破碎，12 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書，分別測定各組VEGF、bFGF及PDGF蛋白表達(dá)情況。

1.2.5qPCR檢測人皮膚成纖維細(xì)胞中VEGF、bFGF、PDGF mRNA表達(dá)水平電子束照射后24 h收集各實驗組HFF-1細(xì)胞。利用RNAsimple總RNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行qPCR檢測。PCR引物序列見表1。反應(yīng)體系（25 μL）：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（2×）12.5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O9.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火/延伸20 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算VEGF、bFGF、PDGF經(jīng)GAPDH標(biāo)化后的相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP對放射損傷皮膚成纖維細(xì)胞分泌功能的影響

2.1.1 各組HFF-1細(xì)胞培養(yǎng)基中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及CGRP表達(dá)水平比較與0 Gy組比較，各照射組（2 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy組）Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ均升高，照射組（12 Gy、18 Gy組）Col-Ⅲ升高，照射組（6 Gy、12 Gy、18 Gy組）CGRP升高。照射前給予SP干預(yù)后，與未SP干預(yù)的相應(yīng)組相比：0 Gy+SP組除Col-Ⅲ降低外，各指標(biāo)水平均升高；2 Gy+SP組Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，Col-Ⅲ、CGRP升高；6 Gy+SP組Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，CGRP升高；12 Gy+SP組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ升高，Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低；18 Gy+SP組Col-Ⅲ升高，Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of Col-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between different culture medium groups表2各組培養(yǎng)基Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of Col-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between different culture medium groups表2各組培養(yǎng)基Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與0 Gy組比較，b與2 Gy組比較，c與6 Gy組比較，d與12 Gy組比較，e與18 Gy組比較，P＜0.05。

組別0 Gy組2 Gy組6 Gy組12 Gy組18 Gy組0 Gy+SP組2 Gy+SP組6 Gy+SP組12 Gy+SP組18 Gy+SP組F Col-Ⅰ（μg/L）14.34±0.25 20.50±0.19a 19.31±0.51a 21.07±0.84a 26.33±0.63a 21.86±0.93a 18.22±0.63b 16.10±0.57c 23.31±1.25d 25.07±0.99 76.684＊＊Col-Ⅲ（μg/L）31.50±0.69 30.14±0.35 32.52±1.18 33.37±0.74a 33.50±0.74a 28.16±1.26a 31.97±0.57b 33.35±1.01 42.24±1.15d 41.37±0.74e 77.852＊＊Col-Ⅰ/Col-Ⅲ0.46±0.02 0.68±0.01a 0.59±0.03a 0.63±0.02a 0.79±0.03a 0.78±0.01a 0.57±0.01b 0.48±0.03c 0.55±0.02d 0.61±0.02e 80.440＊＊CGRP（ng/L）52.48±2.04 53.07±3.50 61.48±1.86a 99.91±4.94a 103.80±2.82a 62.57±4.17a 76.89±4.11b 98.92±2.78c 102.29±3.64 108.88±3.13 135.039＊＊

2.1.2 各組HFF-1細(xì)胞內(nèi)源Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及CGRP表達(dá)水平比較與0 Gy組比較，各照射組（2 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy組）CGRP升高，照射組（6 Gy、18 Gy組）Col-Ⅰ、Col-Ⅲ升高，照射組（18 Gy組）Col-Ⅰ/Col-Ⅲ升高（均P＜0.05）。照射前給予SP干預(yù)后，與未SP干預(yù)的相應(yīng)組相比：0 Gy+SP組CGRP升高；2 Gy+SP組各指標(biāo)水平均降低；6 Gy+SP組Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，CGRP升高；12 Gy+SP組除Col-Ⅰ/Col-Ⅲ，其余各指標(biāo)水平均降低；18 Gy+SP組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，CGRP升高（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of the expression levels of endogenousCol-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between the ten groups表3各組細(xì)胞內(nèi)源Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of the expression levels of endogenousCol-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between the ten groups表3各組細(xì)胞內(nèi)源Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與0 Gy組比較，b與2 Gy組比較，c與6 Gy組比較，d與12 Gy組比較，e與18 Gy組比較，P＜0.05。

組別0 Gy組2 Gy組6 Gy組12 Gy組18 Gy組0 Gy+SP組2 Gy+SP組6 Gy+SP組12 Gy+SP組18 Gy+SP組F Col-Ⅰ（μg/L）38.78±0.53 39.10±0.62 42.98±1.28a 39.69±1.12 43.86±0.71a 37.81±0.49 33.64±0.42b 37.25±0.31c 38.19±0.37d 37.19±0.44e 52.361＊＊Col-Ⅲ（μg/L）73.59±0.66 72.29±0.90 78.70±1.94a 72.84±0.62 78.05±1.83a 72.13±0.90 65.40±1.88b 79.14±1.70 68.44±0.77d 70.83±0.84e 34.876＊＊Col-Ⅰ/Col-Ⅲ0.53±0.01 0.54±0.01 0.55±0.00 0.54±0.02 0.56±0.01a 0.52±0.01 0.51±0.02b 0.47±0.01c 0.56±0.01 0.53±0.00e 14.151＊＊CGRP（ng/L）26.56±0.61 33.53±0.71a 31.10±0.58a 32.55±0.73a 31.48±0.09a 29.52±1.25a 28.81±0.41b 32.70±0.96c 31.07±0.95d 38.15±0.58e 51.309＊＊

2.2 SP對放射損傷皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞因子表達(dá)的影響

2.2.1 各組HFF-1細(xì)胞VEGF、bFGF、PDGF mRNA表達(dá)水平比較與0 Gy組比較，照射組（2 Gy組）VEGF降低，照射組（6 Gy、12 Gy、18 Gy組）bFGF、PDGF均升高（均P＜0.05）。照射前給予SP干預(yù)后，與未SP干預(yù)的相應(yīng)組相比：0 Gy+SP組各指標(biāo)水平均升高；2 Gy+SP組VEGF、bFGF升高；6 Gy+SP組VEGF降低；12 Gy+SP組和18 Gy+SP組各指標(biāo)水平均升高（均P＜0.05），見表4。

2.2.2 各組HFF-1細(xì)胞VEGF、bFGF、PDGF蛋白表達(dá)水平比較與0 Gy組比較，照射組（2 Gy、18 Gy組）各指標(biāo)水平均升高，照射組（6 Gy組）VEGF升高，照射組（12 Gy組）VEGF、bFGF均升高（均P＜0.05）。照射前給予SP干預(yù)后，與未SP干預(yù)的相應(yīng)組相比：0 Gy+SP組和2 Gy+SP組均呈現(xiàn)VEGF升高，bFGF降 低；6 Gy+SP組VEGF升 高；12 Gy+SP組VEGF、PDGF升高，bFGF降低；18 Gy+SP組VEGF、PDGF均升高（均P＜0.05），見表5。

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表4各組VEGF、bFGF、PDGF mRNA表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表4各組VEGF、bFGF、PDGF mRNA表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與0 Gy組比較，b與2 Gy組比較，c與6 Gy組比較，d與12 Gy組比較，e與18 Gy組比較，P＜0.05。

組別0 Gy組2 Gy組6 Gy組12 Gy組18 Gy組0 Gy+SP組2 Gy+SP組6 Gy+SP組12 Gy+SP組18 Gy+SP組F VEGF mRNA 1.00±0.00 0.75±0.04a 1.13±0.10 1.09±0.12 1.03±0.03 1.64±0.16a 1.28±0.04b 0.86±0.04c 2.31±0.01d 2.14±0.22e 81.916＊＊bFGF mRNA 1.00±0.00 1.12±0.11 1.70±0.44a 1.51±0.28a 1.65±0.33a 1.55±0.15a 1.65±0.09b 1.55±0.39 1.98±0.04d 2.62±0.32e 8.663＊＊PDGF mRNA 1.00±0.00 1.31±0.06 1.62±0.16a 1.80±0.20a 1.90±0.09a 1.57±0.14a 1.57±0.17 1.54±0.37 2.45±0.45d 2.42±0.27e 11.405＊＊

Tab.5 Comparison of protein expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表5各組VEGF、bFGF、PDGF蛋白表達(dá)水平比較（n=3，ng/L，±s）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表5各組VEGF、bFGF、PDGF蛋白表達(dá)水平比較（n=3，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與0 Gy組比較，b與2 Gy組比較，c與6 Gy組比較，d與12 Gy組比較，e與18 Gy組比較，P＜0.05。

組別0 Gy組2 Gy組6 Gy組12 Gy組18 Gy組0 Gy+SP組2 Gy+SP組6 Gy+SP組12 Gy+SP組18 Gy+SP組F VEGF 788.84±41.15 856.82±24.47a 954.71±23.71a 1 090.68±15.14a 1 140.53±24.67a 1 100.65±29.08a 1 174.97±21.75b 1 065.30±40.36c 1 285.55±21.81d 1 317.28±26.13e 112.077＊＊bFGF 24.92±0.28 26.90±0.59a 24.75±0.28 25.93±0.27a 26.92±0.94a 19.77±0.34a 20.34±0.34b 25.33±0.34 22.42±0.22d 27.64±0.36 114.822＊＊PDGF 12.02±0.21 12.50±0.40a 11.74±0.19 12.18±0.22 12.66±0.32a 12.23±0.22 12.83±0.30 11.85±0.21 13.09±0.18d 14.78±0.21e 36.113＊＊

3 討論

放射性皮膚潰瘍創(chuàng)面破潰難愈是其治療難點。傷口愈合是一個復(fù)雜、高度可調(diào)的過程，由多種細(xì)胞及分子介導(dǎo)，主要包括炎癥期、新生組織形成期及組織重塑期［4］。在創(chuàng)面環(huán)境的應(yīng)激條件下，成纖維細(xì)胞通過分泌多種信號分子參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接通訊以及自分泌和旁分泌的相互作用，從而調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能［1，5］。SP作為局部傷口愈合重要介導(dǎo)因子，可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖、分泌功能，進(jìn)而促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合［4，6-7］。

真皮成纖維細(xì)胞主要通過合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分（包括Col-Ⅰ和Col-Ⅲ）在傷口愈合中發(fā)揮重要作用。膠原蛋白是組織再生過程中一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)，為組織細(xì)胞提供支撐，維持其生理結(jié)構(gòu)和功能［4，8］。皮膚真皮中的膠原蛋白主要是Col-Ⅰ和Col-Ⅲ。其表達(dá)分泌量不僅決定了真皮修復(fù)的進(jìn)程，其比例也影響真皮瘢痕的結(jié)構(gòu)和功能。在傷口愈合中，Col-Ⅰ的大量出現(xiàn)導(dǎo)致瘢痕結(jié)構(gòu)質(zhì)地堅硬而缺乏彈性；Col-Ⅲ是皮膚中網(wǎng)狀纖維的主要組成部分，含量越高纖維束越細(xì)，在創(chuàng)傷修復(fù)中，Col-Ⅲ高表達(dá)有利于皮膚組織細(xì)膩柔潤［9］。本研究通過對細(xì)胞培養(yǎng)基中膠原蛋白含量分析來闡述皮膚成纖維細(xì)胞對膠原蛋白的分泌功能，結(jié)果顯示，電子束照射后，與0 Gy組比較，隨著照射劑量增加，各照射組細(xì)胞培養(yǎng)基中Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ升高趨勢明顯，照射前給予SP干預(yù)，發(fā)現(xiàn)低照射劑量組（2 Gy、6 Gy組）Col-Ⅰ降低明顯，高照射劑量組（12 Gy、18 Gy組）Col-Ⅲ升高明顯，但各照射組均呈現(xiàn)Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，表明外源SP可降低照射后皮膚成纖維細(xì)胞中Col-Ⅰ/Col-Ⅲ，提示SP可通過調(diào)節(jié)Col-Ⅰ/Col-Ⅲ，誘發(fā)真皮瘢痕組織結(jié)構(gòu)的改變，有利于皮膚瘢痕軟化。為進(jìn)一步確證上述調(diào)節(jié)關(guān)系，對電子束照射前后及SP干預(yù)情況下，細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析表明，電子束照射后，僅高劑量18 Gy組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ指標(biāo)與培養(yǎng)基中表達(dá)變化一致，其他劑量組Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ指標(biāo)表達(dá)趨勢不一致；外源SP干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ和Col-Ⅰ/Col-Ⅲ分別在干預(yù)組（2 Gy+SP、6 Gy+SP組）和（2 Gy+SP、6 Gy+SP、18 Gy+SP組）與培養(yǎng)基中表達(dá)變化一致。

在傷口愈合過程中，細(xì)胞和分子級聯(lián)過程伴隨著多種細(xì)胞因子參與。作為首個被批準(zhǔn)用于治療潰瘍的生長因子，PDGF可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的分裂，膠原的合成及血管生成。bFGF可促進(jìn)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等向損傷部位遷移，加速創(chuàng)面肉芽生長與血管形成，進(jìn)而改善創(chuàng)傷組織供血環(huán)境，縮短創(chuàng)傷愈合時間。VEGF通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂與增殖，促進(jìn)微血管新生，提高血管通透性，進(jìn)而加速傷口愈合［10-12］。Kant等［13］研究表明，局部應(yīng)用SP可通過對細(xì)胞因子、生長因子等的調(diào)節(jié)，促進(jìn)傷口愈合?；蛘{(diào)控對外界刺激反映在基因表達(dá)的各個環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，電子束照射后，僅bFGF在高劑量組（12 Gy、18 Gy組）呈現(xiàn)蛋白和mRNA水平表達(dá)變化一致性；SP干預(yù)后，VEGF和PDGF在高劑量組（12 Gy+SP、18 Gy+SP組）呈現(xiàn)蛋白和mRNA一致性高表達(dá)，表明細(xì)胞因子合成調(diào)節(jié)可能是皮膚成纖維細(xì)胞在應(yīng)激條件下為減少輻射損傷的一種生物學(xué)調(diào)節(jié)反應(yīng)，SP可協(xié)同皮膚成纖維細(xì)胞對輻射照射的應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而參與傷口創(chuàng)面愈合微環(huán)境的調(diào)控。

綜上所述，SP干預(yù)可調(diào)節(jié)放射損傷皮膚成纖維細(xì)胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達(dá)與分泌，降低Col-Ⅰ/Col-Ⅲ比值，協(xié)同成纖維細(xì)胞對電子束照射的應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)放射損傷皮膚成纖維細(xì)胞中VEGF、PDGF的高表達(dá)。本研究為SP用于放射性皮膚損傷治療干預(yù)提供了數(shù)據(jù)支持。