尹建雯，賈森泉，周永明，古文鵬，趙智嫻

(云南省疾病預(yù)防控制中心 急性傳染病防制所，云南 昆明 650022)

沙門氏菌是全球范圍內(nèi)報(bào)道最多，各國公認(rèn)的食源性疾病所致感染性腹瀉的首要致病菌[1]，血清型種類繁多，其中鼠傷寒沙門氏菌屬于常見血清型之一，廣泛存在于自然環(huán)境和人類食物飲用水中，可引起食物中毒，造成不同程度腸炎疾病[2，3]，是引起食源性疾病暴發(fā)的優(yōu)勢血清型?？股氐氖褂脤?xì)菌感染起到良好的治療作用，但是也導(dǎo)致大量耐藥菌株，甚至是多重耐藥包括碳青霉烯酶耐藥、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrum β-lactamase，ESBLs)耐藥，使得抗生素的使用范圍越來越窄。鼠傷寒沙門氏菌的臨床耐藥情況不容忽視[4]。本研究從健康服務(wù)從業(yè)人員的肛拭標(biāo)本中分離出的鼠傷寒沙門氏菌中篩選出ESBLs的菌株，再進(jìn)行耐藥分析及脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析，了解鼠傷寒沙門菌的耐藥情況，為鼠傷寒沙門氏菌的監(jiān)測提供參考。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

挑選2016—2018年某區(qū)健康服務(wù)從業(yè)人員體檢肛拭標(biāo)本，共60533份(其中2016年15321份。2017年17618份，2018年27594份，共檢出鼠傷寒沙門氏菌68株，其中產(chǎn)ESBLs的6株。

1.1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)儀、PFGE、凝膠成像儀。

磺胺增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、三糖鐵瓊脂，全自動生化革蘭氏陰性菌[(Gram-negative，GN)鑒定卡(簡稱GN卡)]、沙門菌診斷血清、ESBLs選擇培養(yǎng)基、沙門氏菌診斷血清、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(TAKARA)、蛋白酶K(Merck)、Seakem Gold Agarose(LONZA)、Tris-Hcl(SolarBio)、EDTA(SolarBio)、TBE(SolarBio)、Gelred(biotium)，PCR Mix(TAKARA)、瓊脂糖(Bio-Rad)、DNA Marker2000(TAKARA)、革蘭氏陰性需氧菌藥敏檢測板，均在有效期內(nèi)使用。抗生素藥敏檢測板包括：氨芐青霉素(Ampicillin，AMP)、氨芐西林-舒巴坦(Ampicillin Sodium and Sulbactam Sodium，AMS)、四環(huán)素(Tetracyclines，TET)、氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、復(fù)方新諾明(Sulfamethoxazole，SMZ)、頭孢唑林(Cefazolin，CFZ)、頭孢噻肟(Cefotaxime，CTX)、頭孢他啶(Cazpentahydrate，CAZ)、頭孢西丁(Cefoxitin，CFX)、慶大霉素(Gentamycin，GEN)、亞胺培南(Imipenem，IMI)、萘啶酸(Nalidixic Acid，NAL)、阿奇霉素(Azithromycin，AZI)、磺胺異噁唑(Sulfisoxazole，Sul)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、阿莫西林-克拉維酸(Amoxicillin and Clavulanate，AMC)、頭孢噻肟-克拉維酸(CefotaximeSodiumsalt-Claforan，CTX-C)、頭孢他啶-克拉維酸(Cazpentahydrate-Claforan，CAZ-C)、多黏菌素B(Polymyxin B，PB)、多黏菌素E(Colistin，CT)、米諾環(huán)素(Minocycline，MIN)、阿米卡星(Amiklin，AMI)、氨曲南(Aztreonam，AZM)、美羅培南(Meropenem，MEM)、頭孢吡肟(Cefepime，CAS)、左氧氟沙星(Levofloxacin，LEV)、多西環(huán)素(Doxycycline，DOX)、卡那霉素(Kanamycin，KAN)、鏈霉素(Streptomycin，STR)、吉米沙星(Gemifloxacin，GEM)。PCR引物為某公司合成，引物序列見表1。

表1 耐藥基因引物序列及目的片段、退火溫度

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離鑒定

參照GB/T 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》[5]和WS 280-2008《傷寒和副傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)》[6]進(jìn)行沙門菌檢驗(yàn)。從業(yè)人員肛拭標(biāo)本用SBG肉湯36 ℃增菌18～24 h；取增菌液分別劃線至XLD，36 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種于三糖鐵斜面，36 ℃培養(yǎng)18～24 h，生化符合的進(jìn)行全自動細(xì)菌生化系統(tǒng)鑒定，鑒定卡為GN卡。經(jīng)生化鑒定為沙門菌的進(jìn)行血清分型鑒定。典型鼠傷寒沙門菌血清型為1，4，5，12 ∶i ∶1，2[7]。鑒定為鼠傷寒沙門菌的接種于ESBLs耐藥培養(yǎng)基，挑取生長的菌株進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 耐藥基因鑒定

采用DNA提取試劑盒提取基因組為模版，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，PCR轉(zhuǎn)錄完成后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。產(chǎn)物由某生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果采用相關(guān)軟件進(jìn)行編輯處理，隨后在采用BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，獲得準(zhǔn)確的ESBLs基因型別。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

挑取對數(shù)生長期的純菌落加入生理鹽水稀釋管中混勻，調(diào)整菌懸液濃度至0.5 McF，取60 μL菌懸液至肉湯接種管中，使用全自動菌液接種儀加入96孔藥敏板中，每孔100 μL，陰性對照孔加無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液100 μL。將藥敏板放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18～20 h后判讀結(jié)果。以大腸埃希菌(ATCC 25922)作為質(zhì)控菌株。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)獲得相應(yīng)敏感(Susceptible，S)、中度敏感(Intermediate，I)和耐藥(Resistant，R)的結(jié)果。

1.2.4 PFGE分型

按照PulseNet沙門菌PFGE的標(biāo)準(zhǔn)方法[8]，用Sea Kem glod agarose包埋，蛋白酶K裂解，Xba I酶切，所得DNA片段用Chef-mapper進(jìn)行脈沖場凝膠電泳分型，PFGE后染色，用凝膠成像系統(tǒng)獲得圖譜，Marker為H9812，與從腹瀉病例中分離到的兩株鼠傷寒沙門氏菌A、B比較。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因檢測結(jié)果

6株鼠傷寒沙門氏菌耐藥基因PCR檢測，5株檢出blaCTX-M-14和blaTEM-1，1株只檢出blaTEM-1，其余基因未檢出。

2.2 藥敏結(jié)果

6株鼠傷寒沙門氏菌均為多重耐藥菌，均對氨芐青霉素、氨芐青霉素/復(fù)方新諾明、四環(huán)素、頭孢唑林、頭孢噻肟、磺胺異噁唑、米諾環(huán)素、氨曲南、頭孢吡肟、多西環(huán)素、鏈霉素產(chǎn)生耐藥，耐藥率100%，耐藥譜顯示菌株間耐藥情況均不相同，見表2。

表2 6株鼠傷寒沙門菌耐藥譜

2.3 PFGE結(jié)果

所檢6株鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切電泳后，產(chǎn)生12～18條大小不同的片段(見圖1)，為不同帶型，且與從腹瀉病例中分離到的兩株鼠傷寒沙門氏菌A、B比較，帶型也不同。

圖1 6株鼠傷寒沙門氏菌PFGE結(jié)果注：M：H9812；A、B：為腹瀉標(biāo)本檢出的鼠傷寒沙門氏菌

3 討論

細(xì)菌感染治療與防控的過程中，抗生素的使用具有重要意義。1980年第三代頭孢菌素的使用對β-內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的耐藥細(xì)菌治療效果顯著，然后隨著藥物的使用，β-內(nèi)酰胺酶在某些特定物種(大腸埃希菌)大量表達(dá)引起抗性，并且這些耐藥抗性在不同種細(xì)菌間進(jìn)行傳播[9，10]。ESBLs能夠水解青霉素類抗生素、頭孢菌素(主要為第三代頭孢菌素，如頭孢他啶、頭孢哌酮等)和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素(氨曲南、卡蘆莫南等)，從而使細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥。ESBLs基因型主要為TEM、CTX-M、SHV、OXA，成全球分布，可由質(zhì)粒攜帶，可通過融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等機(jī)制進(jìn)行細(xì)菌間傳播轉(zhuǎn)移，從而擴(kuò)大爆發(fā)，我國患者中臨床流行主要為CTX-M[11]。本研究中鼠傷寒的檢出率不高，僅為0.056%，但產(chǎn)ESBLs的菌株就占了17.6%，產(chǎn)ESBLs的菌株在鼠傷寒沙門氏菌中比例非常之高。6株菌中5株鼠傷寒沙門氏菌中均檢出CTX-M-14和TEM-1，表明本地耐藥基因以CTX-M-14和TEM-1為主。與曲梅等[12]關(guān)于北京地區(qū)沙門氏菌耐藥基因以TEM-1為主，CTX-M為輔的結(jié)果相似。6株鼠傷寒沙門菌均為耐12種以上抗菌藥物的多重耐藥菌，對氨芐青霉素、氨芐青霉素/復(fù)方新諾明、四環(huán)素、頭孢唑林、頭孢噻肟、磺胺異噁唑、米諾環(huán)素、氨曲南、頭孢吡肟、多西環(huán)素、鏈霉素產(chǎn)生耐藥，只有一株對氯霉素敏感，其余均耐藥，這與田云萍等[13]研究的云南本地鼠傷寒沙門菌耐藥情況不同，出現(xiàn)了耐更多藥的鼠傷寒沙門菌，說明本地耐藥情況呈多樣性。

PFGE分子分型技術(shù)是細(xì)菌分子分型同源性分析的有效方法，是國際認(rèn)證的對爆發(fā)株區(qū)分和溯源的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。本次試驗(yàn)將分離得到的6株產(chǎn)ESBLs鼠傷寒沙門菌進(jìn)行PFGE分型，并與腹瀉病例中分離到的鼠傷寒沙門菌做對比，顯示健康人群攜帶的鼠傷寒沙門菌都具有不同的帶型，且與腹瀉病例菌株存在差異，說明本地區(qū)鼠傷寒沙門菌存在多樣性。

本研究收集了健康服務(wù)從業(yè)人員體檢人群的肛拭標(biāo)本進(jìn)行耐藥菌研究，并獲得產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的鼠傷寒沙門菌，獲得的6株菌均為耐12種以上抗菌藥物的多重耐藥菌，這與游興勇等[14]關(guān)于餐飲人員帶菌調(diào)查中出現(xiàn)的結(jié)果相識，說明健康人群中攜帶鼠傷寒沙門氏菌和多重耐藥的情況不容忽視。近年鼠傷寒沙門菌引起的感染多以散發(fā)形式報(bào)告，經(jīng)分子分型研究，發(fā)現(xiàn)散發(fā)病例都有一定的聚集傾向[15]，但因缺乏流行病學(xué)信息，不能準(zhǔn)確溯源。因此開展健康服務(wù)從業(yè)人員攜帶沙門氏菌監(jiān)測，及時(shí)監(jiān)控飲食衛(wèi)生，開展預(yù)警，防止鼠傷寒沙門氏菌感染發(fā)生，對健康服務(wù)行業(yè)具有重要意義，同時(shí)也對沙門菌分布和耐藥傳遞調(diào)查具有重要意義。