張明煥 毛文
湖北省武漢市第三醫(yī)院骨科,湖北 武漢 430071
骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種慢性疾病,其病理特征是關(guān)節(jié)軟骨退變和損傷;確定軟骨細胞在OA中的作用不僅可揭示該疾病發(fā)病機制,還可推動針對特異治療靶點的新藥的開發(fā)[1-2]。研究[3-4]表明miRNA、circRNA參與OA的各種病理過程,在骨關(guān)節(jié)炎中具有治療潛力。研究[5]報道circ_SEC24A(hsa_circ_0005105)在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織和白細胞介素-1β(IL-1β)誘導的軟骨細胞中上調(diào),干擾circ_0005105消除了IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡、外基質(zhì)降解以及增殖抑制的作用。然而circ_0005105對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥因子分泌的影響及機制尚未完全清楚。Circular RNA Interactome在線軟件預測發(fā)現(xiàn)circ_0005105與miR-508-3p有結(jié)合位點。研究[6]報道lncRNA PCAT-1通過miR-508-3p/ZEB1軸促進骨肉瘤的進展。而miR-508-3p對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響尚未有研究報道。本實驗旨在研究circ_0005105是否通過調(diào)控miR-508-3p影響IL-1β誘導的軟骨細胞損傷。
人正常軟骨細胞C28/I2(深圳市豪地華拓生物科技有限公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒(日本Takara);CCK-8試劑盒、凋亡檢測試劑盒(日本同仁研究所);蛋白提取試劑盒、TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(艾美捷科技有限公司);白細胞介素-1β(IL-1β)(上海廣銳生物科技有限公司);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國AAT Bioquest);Bax、Bcl-2抗體(美國Abcam);Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3抗體(武漢艾美捷)。
人正常軟骨細胞C28/I2用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),用5 μg/L的IL-1β處理24 h,作為IL-1β組,正常培養(yǎng)的細胞作為NC組;將si-NC、si-hsa_circ_0005105、miR-NC、miR-508-3p轉(zhuǎn)染至軟骨細胞后用5 μg/L的IL-1β處理24 h,記為IL-1β+si-NC組、IL-1β+si-hsa_circ_0005105組、IL-1β+miR-NC組、IL-1β+miR-508-3p組;將si-hsa_circ_0005105分別與anti-miR-NC、anti-miR-508-3p共轉(zhuǎn)染至軟骨細胞后用5 μg/L的IL-1β處理24 h,記為IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-NC組、IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-508-3p組。
提取各組軟骨細胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按試劑盒說明以GAPDH和U6為內(nèi)參進行PCR,相對表達量用2-△△Ct法計算。
提取各組細胞總蛋白,取適量蛋白樣品進SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉1 h,再分別加入抗體(1∶800),4 ℃孵育過夜,洗膜后加山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)室溫孵育1 h,暗室中曝光顯影、定影,計算蛋白相對表達水平。
各組細胞,按試劑盒說明分別加Annexin V-FITC和PI,避光孵育,上流式細胞儀檢測細胞。
各組細胞培養(yǎng)24 h,按試劑盒說明加10 μL CCK-8試劑,孵育2 h后檢測吸光度值(A)。
用6孔板按照每孔500個細胞接種細胞,培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見細胞克隆團,棄培養(yǎng)基,加預冷PBS洗滌,用甲醇固定細胞,其用量為500 μL/孔,固定時間為20 min(-20 ℃),用1 %結(jié)晶紫染色液染色細胞15 min,反應條件為37 ℃,用量為400 μL/孔,蒸餾水洗滌后晾干,拍照并觀察細胞克隆形成數(shù)。
各組細胞培養(yǎng)48 h后收集細胞培養(yǎng)液,按試劑盒說明操作,檢測TNF-α、IL-6水平。
將hsa_circ_0005105野生型和突變型熒光素酶報告質(zhì)粒分別與miR-NC和miR-508-3p共轉(zhuǎn)染至軟骨細胞,按照試劑盒說明操作,檢測細胞熒光素酶活性。
將si-NC、si-hsa_circ_0005105、pcDNA、pcDNA-hsa_circ_0005105轉(zhuǎn)染至軟骨細胞,按1.3中方法檢測hsa_circ_0005105和miR-508-3p表達水平。
與NC組比較,IL-1β組hsa_circ_0005105表達水平升高(1.00±0.10 vs 2.73±0.19)(t=24.172,P<0.05),miR-508-3p表達水平降低(1.00±0.11 vs 0.45±0.04)(t=14.097,P<0.05)。
與NC組比較,IL-1β組hsa_circ_0005105表達水平升高,Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3相對表達水平、細胞凋亡率升高,細胞活性和Bcl-2蛋白水平降低,細胞克隆形成數(shù)減少,TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05);與IL-1β+si-NC組比較,IL-1β+si-hsa_circ_0005105組hsa_circ_0005105表達水平降低,Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3相對表達水平、細胞凋亡率降低,細胞活性和Bcl-2蛋白水平升高,細胞克隆形成數(shù)增多,TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05),見圖1,表1。
注:A:低表達hsa_circ_0005105后軟骨細胞凋亡流式圖;B:低表達hsa_circ_0005105后軟骨細胞克隆形成圖;C:低表達hsa_circ_0005105后Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的相對表達。1:NC;2:IL-1β;3:IL-1β+si-NC;4:IL-1β+si-hsa_circ_0005105。
表1 低表達hsa_circ_0005105抑制IL-1β誘導的軟骨細胞損傷和炎癥因子分泌Table 1 Low expression of hsa_circ_0005105 inhibits IL-1β-induced chondrocyte injury and inflammatory factor
與IL-1β+miR-NC組比較,IL-1β+miR-508-3p組miR-508-3p表達水平、細胞活性、Bcl-2蛋白水平升高,Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3相對表達水平、細胞凋亡率降低,細胞克隆形成數(shù)增多,TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05),見圖2,表2。
表2 過表達miR-508-3p抑制IL-1β誘導的軟骨細胞損傷及炎癥因子分泌Table 2 Overexpression of miR-508-3p inhibits IL-1β-induced chondrocyte injury and inflammatory factor
注:A:過表達miR-508-3p后軟骨細胞凋亡流式圖;B:過表達miR-508-3p后軟骨細胞克隆形成圖;C:過表達miR-508-3p后Bax、Cleaved-caspase-3蛋白相對表達。1:IL-1β+miR-NC;2:IL-1β+miR-508-3p。
Circular RNA Interactome預測顯示hsa_circ_0005105和miR-508-3p存在結(jié)合位點(圖3)。miR-508-3p與hsa_circ_0005105熒光素酶活性降低(1.00±0.10 vs 0.41±0.04)(t=16.434,P<0.05)。與si-NC組比較,si-hsa_circ_0005105組hsa_circ_0005105表達水平降低(1.00±0.10 vs 0.35±0.04),miR-508-3p表達水平升高(1.00±0.10 vs 2.24±0.17)(P<0.05);與pcDNA組比較,pcDNA-hsa_circ_0005105組hsa_circ_0005105表達水平升高(1.02±0.09 vs 2.18±0.18),miR-508-3p表達水平降低(1.02±0.11 vs 0.44±0.04)(P<0.05)。
圖3 Circular RNA Interactome對hsa_circ_0005105和miR-508-3p結(jié)合進行預測示意圖Fig.3 Schematic diagram of the prediction of the binding of hsa_circ_0005105 and miR-508-3p by circular RNA Interactome
與IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-NC組比較,IL-1β+si-hsa_circ_0005105 +anti-miR-508-3p組miR-508-3p表達水平降低,Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3相對表達水平、細胞凋亡率升高,細胞活性和Bcl-2蛋白水平降低,細胞克隆形成數(shù)減少,TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05),見圖4,表3。
表3 低表達miR-508-3p可以逆轉(zhuǎn)hsa_circ_0005105低表達對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響
注:A:低表達miR-508-3p和hsa_circ_0005105后軟骨細胞凋亡情況;B:低表達miR-508-3p和hsa_circ_0005105后軟骨細胞而克隆形成情況;C:低表達miR-508-3p和hsa_circ_0005105后Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的相對表達。1:IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-NC;2:IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-508-3p。
骨關(guān)節(jié)炎是常發(fā)生于中老年人群的骨科疾病,基因治療是骨關(guān)節(jié)炎的一種新興治療方式;尋找相關(guān)的生物標志物,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點已經(jīng)成為研究熱點之一[7-8]。研究[9-10]表明circRNA是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生,發(fā)展的重要環(huán)節(jié),能夠作為診斷標志物和生物治療靶點,深入的了解circRNA在骨關(guān)節(jié)炎中的作用機制,以期為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供理論基礎(chǔ)及新的靶點和新的治療方法。研究[11]報道IL-1β刺激的軟骨細胞中hsa_circ_0005105 表達顯著上調(diào),hsa_circ_0005105通過海綿miR-26a上調(diào)NAMPT表達并促進軟骨細胞外基質(zhì)降解。此外,circ_0005105在胰腺導管癌組織和細胞系中均上調(diào)表達,促進癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[12]。IL-1β被認為是骨關(guān)節(jié)炎的主要誘因,本研究用IL-1β誘導軟骨細胞建立骨模型,IL-1β誘導的軟骨細胞中hsa_circ_0005105表達水平也升高,與前人研究結(jié)果一致[11]。本研究低表達hsa_circ_0005105后,IL-1β誘導的軟骨細胞中Bax、Cleaved-caspase-3相對表達水平降低,細胞凋亡率降低,細胞活性升高;表明低表達hsa_circ_0005105可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡,促進細胞增殖。炎癥在骨關(guān)節(jié)炎的進展中起重要作用,加強對炎癥細胞因子的研究可能會提高骨關(guān)節(jié)炎的治療潛力[13-14]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),低表達hsa_circ_0005105后,炎癥因子TNF-α和IL-6水平降低,表明低表達hsa_circ_0005105還可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞中炎癥因子的分泌。
研究[15-17]報道m(xù)iR-508-3p可參與調(diào)控卵巢癌、透明細胞腎細胞、胃癌等多種腫瘤的進展。然而miR-508-3p對骨關(guān)節(jié)炎的影響尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-508-3p表達水平降低,過表達miR-508-3p后IL-1β誘導的軟骨細胞中Bax、Cleaved-caspase-3相對表達水平降低,細胞凋亡率降低,細胞活性升高,TNF-α和IL-6水平降低;提示過表達miR-508-3p可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥因子釋放,促進細胞增殖。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005105靶向調(diào)控miR-508-3p;低表達miR-508-3p可以逆轉(zhuǎn)hsa_circ_0005105低表達對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷及炎癥因子分泌的影響。
綜上所述,hsa_circ_0005105通過靶向上調(diào)miR-508-3p減輕IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡及炎癥因子分泌,促進細胞增殖。