常俊杰 解強(qiáng) 劉亦冰 戴文昊 高俊,2* 張曦,2

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)常州附屬醫(yī)院，江蘇 常州 213003 2.張曦名中醫(yī)工作室，江蘇 常州 213003

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)是一種繼發(fā)于糖尿病的全身性的代謝性骨病。在高糖(high glucose，HG)環(huán)境下，無(wú)論是1型糖尿病還是2型糖尿病，骨形成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡均被打破，引起骨代謝紊亂。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多譜系分化及自我更新的潛能，因此成為研究骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制的重要靶點(diǎn)，也憑其來(lái)源廣泛、免疫原性低等優(yōu)勢(shì)成為骨組織工程理想的種子細(xì)胞。本文綜述HG對(duì)BMSCs的作用機(jī)制，有利于突破DOP干細(xì)胞療法的局限性，挖掘潛能優(yōu)勢(shì)。

1 BMSCs與DOP的關(guān)系概述

在骨髓微環(huán)境中，BMSCs的增殖、凋亡、分化、遷移等參與了骨代謝這一復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。在長(zhǎng)期HG環(huán)境下，干細(xì)胞會(huì)發(fā)生代謝紊亂，具體表現(xiàn)為，提前老化甚至凋亡、增殖受損、遷移緩慢、分化及旁分泌功能障礙等[1]。BMSCs的功能改變與功能障礙是DOP病態(tài)骨代謝模式的根本原因[2]，因此，BMSCs的功能活性與DOP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

目前，不論是糖尿病還是骨質(zhì)疏松癥，其治療不僅僅局限于藥物療法，而更多擴(kuò)展到細(xì)胞療法。越來(lái)越多的研究[3]表明，BMSCs在二者治療方面都發(fā)揮了巨大的潛力。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，將BMSCs植入顱骨缺損大鼠模型中，不僅可以觀察到新骨形成，同時(shí)堿性磷酸酶等成骨標(biāo)志物的表達(dá)也有所升高。然而，許多研究證實(shí)，移植到糖尿病患者體內(nèi)的BMSCs由于長(zhǎng)期受到HG環(huán)境的“污染”，導(dǎo)致其出現(xiàn)衰老凋亡、增殖能力降低、成骨分化受損等一系列的不良表現(xiàn)，降低了其功能效應(yīng)，甚至引發(fā)骨質(zhì)疏松癥，這無(wú)疑限制了BMSCs對(duì)DOP的治療效益與應(yīng)用價(jià)值。因此，深入研究HG對(duì)BMSCs的作用機(jī)制有利于為臨床治療DOP提供新思路。

2 HG對(duì)BMSCs的作用機(jī)制

2.1 HG影響B(tài)MSCs增殖

綜合多個(gè)HG對(duì)BMSCs增殖影響的研究，我們發(fā)現(xiàn)，由于實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞種屬、細(xì)胞系、培養(yǎng)方式等的不同，結(jié)果不一。蔣孟佚[5]研究顯示，長(zhǎng)期HG會(huì)削減大鼠BMSCs的增殖。但Li等[6]證實(shí)，HG對(duì)人BMSCs與大鼠BMSCs增殖影響的結(jié)果相反，即HG會(huì)促進(jìn)人BMSCs的增殖，其原因大概是，與鼠BMSCs相較，人BMSCs的干細(xì)胞特性更強(qiáng)，可以抵抗HG毒性。此外，趙同平等[7]研究認(rèn)為，HG在短期內(nèi)可以增強(qiáng)小鼠BMSCs增殖水平,但長(zhǎng)期來(lái)看，HG又會(huì)抑制這種增殖效應(yīng)。對(duì)于不同葡萄糖水平的定義，韋恩秀等[8]提出，處于細(xì)胞增殖峰值的葡萄糖水平為正糖，低或高于此水平則分別稱之為低糖或HG，且在實(shí)驗(yàn)研究中，將小鼠BMSCs增殖活性最佳的22.5和50.0 mmol/L葡萄糖水平定為正糖，并發(fā)現(xiàn)，經(jīng)22.5 mmol/L正糖預(yù)處理后，更換不同葡萄糖濃度再持續(xù)培養(yǎng)時(shí)，與正糖狀態(tài)相比，100～300 mmol/L的短暫HG具有促增殖作用，即短暫HG可以提高小鼠BMSCs增殖水平，而且這種短暫HG促增殖作用只對(duì)正糖預(yù)處理成立，對(duì)低糖預(yù)處理或交替培養(yǎng)不成立，然而，無(wú)論是HG持續(xù)性培養(yǎng)還是HG間歇性培養(yǎng)，一旦時(shí)間延長(zhǎng)，都會(huì)抑制BMSCs增殖。

2.2 HG促進(jìn)BMSCs凋亡

細(xì)胞凋亡是在一系列凋亡信號(hào)誘導(dǎo)下引發(fā)細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生主動(dòng)死亡。研究[9]表明，HG(55 mmol/L)可提高小鼠BMSCs凋亡率，長(zhǎng)期HG會(huì)引起晚期糖基化終末產(chǎn)物積累，導(dǎo)致BMSCs凋亡。由于HG可以誘發(fā)氧化應(yīng)激，程韶等[10]研究認(rèn)為，大量活性氧能介導(dǎo)Wnt/β-catenin、Pl3K/AKT等信號(hào)通路，使BMSCs凋亡與衰老，進(jìn)而使骨重建失衡。另有研究[11]表明，以HG高脂或炎性因子等來(lái)模擬糖尿病微環(huán)境能夠引起B(yǎng)MSCs凋亡。

2.3 HG促進(jìn)BMSCs自噬

自噬是真核細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，產(chǎn)生自噬溶酶體，降解自身內(nèi)部受損細(xì)胞器、大分子蛋白質(zhì)等，進(jìn)而調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子等的表達(dá)，以介導(dǎo)機(jī)體新陳代謝的一類機(jī)體損傷保護(hù)機(jī)制。Beclin1和LC3Ⅱ是自噬相關(guān)因子，其表達(dá)變化可以反映細(xì)胞自噬程度[12]?，F(xiàn)代研究指出自噬與骨代謝疾病緊密相關(guān)，自噬介導(dǎo)的骨代謝失衡是多種骨病的根源。研究[13]發(fā)現(xiàn)，自噬可以通過(guò)Hedgehog、Wnt/β-catenin、AMPK/mTOR、BMPs/Smad、RANK/RANKL等信號(hào)通路調(diào)節(jié)2型糖尿病骨代謝。劉艷等[12]研究認(rèn)為，HG會(huì)促進(jìn)BMSCs中Beclin1和LC3Ⅱ的表達(dá)，使細(xì)胞產(chǎn)生更多的自噬體，表明HG環(huán)境可以增強(qiáng)BMSCs的自噬程度，揭示了BMSCs的自噬失衡可能與DOP相關(guān)。張平[14]也指出，在HG高胰島素狀態(tài)下，BMSCs會(huì)加速衰老，其自噬程度會(huì)得到加強(qiáng)。同時(shí)，HG狀態(tài)下，BMSCs表現(xiàn)出早衰傾向，IL-6等衰老相關(guān)炎性細(xì)胞因子分泌增加，BMSCs可能是通過(guò)自噬介導(dǎo)的衰老來(lái)避免凋亡以保持細(xì)胞存活。此外，DOP的發(fā)生與細(xì)胞氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)，而線粒體是細(xì)胞氧化應(yīng)激發(fā)生的主要場(chǎng)所。因此，線粒體功能受損對(duì)于BMSCs的成骨分化有一定的抑制作用[15]。線粒體自噬被認(rèn)為是一種降解受損或老化的線粒體的特殊細(xì)胞存活機(jī)制[16]。近年來(lái)一些研究[17]發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬和BMSCs的成骨分化密切相關(guān)，而且HG可能會(huì)抑制大鼠BMSCs在成骨分化過(guò)程中的線粒體自噬現(xiàn)象。

2.4 HG誘導(dǎo)BMSCs鐵死亡

鐵死亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的區(qū)別于細(xì)胞凋亡、自噬、壞死等的一種氧化性死亡方式，其特征表現(xiàn)為鐵依賴性的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧生成與降解失調(diào)[18]。有研究[19]指出，DOP與慢性鐵蓄積導(dǎo)致的活性氧升高密切相關(guān)。張希等[20]研究認(rèn)為，HG會(huì)引起B(yǎng)MSCs內(nèi)的活性氧和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增加，且使BMSCs線粒體萎縮、膜密度增加、內(nèi)膜嵴減少，從而使BMSCs發(fā)生鐵死亡，抑制其成骨分化?，F(xiàn)代研究關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未完全闡明，但部分研究[21]指出，鐵過(guò)載可以抑制BMSCs的Wnt信號(hào)，誘導(dǎo)鐵死亡，從而抑制BMSCs成骨分化，過(guò)量的鐵通過(guò)下調(diào)BMSCs中Runx2的表達(dá)來(lái)抑制其成骨分化[22]，鐵過(guò)載誘導(dǎo)BMSCs產(chǎn)生活性氧，從而干擾了BMSCs成骨分化過(guò)程[23]。然而，在HG環(huán)境下，有關(guān)BMSCs鐵代謝與骨代謝的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。

2.5 HG誘導(dǎo)BMSCs分化

來(lái)源于胚胎時(shí)期中胚層的BMSCs具有多向分化的潛能，可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種類型。

2.5.1成脂-成骨分化：BMSCs成骨分化在骨形成、維持及骨重建中都具有著重要的作用。目前影響B(tài)MSCs成骨分化的信號(hào)通路包括RANKL/RANK/OPG、Wnt、MAPK、AGEs/RAGE、Smad、Notch等，炎癥、氧化應(yīng)激等狀態(tài)也影響B(tài)MSCs的分化能力。目前普遍認(rèn)為PPARγ(過(guò)氧化物酶體增值激活受體)、Runx2是影響B(tài)MSCs成骨和成脂分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Wnt/β-catenin是影響B(tài)MSCs成骨和成脂分化的關(guān)鍵信號(hào)通路[24]。然而迄今為止，由于細(xì)胞來(lái)源不同或細(xì)胞代謝需求等的原因，HG對(duì)BMSCs的成骨分化存在一些爭(zhēng)議。Yamawaki等[25]認(rèn)為在HG環(huán)境下BMSCs可以產(chǎn)生更多的骨鈣素和鈣沉積，另有一些研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs的功能依賴于葡萄糖的攝取。然而，更多的研究[26-28]發(fā)現(xiàn)，HG可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-493-5p/ZEB2或GSK3β、Hedgehog、NF-κB信號(hào)通路抑制BMSCs成骨分化。此外，HG還會(huì)促進(jìn)BMSCs成脂分化，導(dǎo)致脂肪在骨髓腔中積累，進(jìn)而使骨質(zhì)、骨強(qiáng)度下降[29]。HG通過(guò)促進(jìn)BMSCs的脂滴形成及PPARγ等成脂分化標(biāo)志基因的上調(diào)表達(dá)，而減緩鈣結(jié)節(jié)形成，抑制Runx2等成骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)來(lái)干擾其向成骨分化[30]。

2.5.2成血管-成骨分化：骨組織是一種高度血管化的組織，在靜息狀態(tài)下，骨血流量可占心輸出量的10 %～15 %[31]。骨內(nèi)血管不僅可以提供營(yíng)養(yǎng)支持、運(yùn)送代謝產(chǎn)物，而且與骨形成密切相關(guān)，是保持骨組織結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵因素。集中在生長(zhǎng)板干骺端、骨內(nèi)膜、骨膜下區(qū)域的H型血管可以介導(dǎo)血管生成和骨形成的偶聯(lián)過(guò)程[32]。H型血管的豐富度是評(píng)價(jià)機(jī)體衰老和骨量多少的敏感指標(biāo)[33]。研究[34]表明，年齡相關(guān)的H型血管減少與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，受損的骨量可以通過(guò)促進(jìn)H型血管的生成來(lái)得到改善。H型血管可以參與調(diào)控BMSCs的分化過(guò)程[35]，BMSCs可以通過(guò)促血管生成從而促進(jìn)成骨。HG會(huì)抑制BMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化[36]，而且HG削弱BMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的機(jī)制可能就是HG自身或受其干預(yù)的生長(zhǎng)因子促進(jìn)了BMSCs的凋亡，使BMSCs的增殖受損，從而使BMSCs成血管分化能力減弱。

2.6 HG影響B(tài)MSCs的定向遷移

BMSCs進(jìn)入外周血循環(huán)時(shí)，在各種因子的相互作用下，可以附著在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，同時(shí)G蛋白偶聯(lián)受體與其結(jié)合，經(jīng)激活的BMSCs能夠在骨受損區(qū)參與骨形成過(guò)程，在骨損傷的再生修復(fù)過(guò)程中，BMSCs的募集發(fā)揮了重要作用[37]。BMSCs向骨受損區(qū)的募集與其定向遷移能力密切相關(guān)，而且應(yīng)用BMSCs治療骨質(zhì)疏松癥時(shí)，需要其定向遷移至骨組織才能使治療效益最大化。

趨化因子及其受體是調(diào)控BMSCs定向遷移的重要因素?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)是一種趨化因子，與其G蛋白偶聯(lián)受體CXCR-4相互作用可發(fā)揮細(xì)胞趨化功能。許多研究表明，SDF-1在骨受損區(qū)高度表達(dá)，BMSCs可以在SDF-1/CXCR-4通路的趨化作用下，定向遷移至骨受損區(qū)，從而發(fā)揮骨形成功能。然而，張博[38]發(fā)現(xiàn)，在HG環(huán)境下，CXCR-4的表達(dá)受抑制，從而影響SDF-1/CXCR-4通路對(duì)BMSCs定向遷移能力的調(diào)控。此外，HG會(huì)使BMSCs過(guò)早老化，分泌大量炎性因子，抑制BMSCs的定向遷移。唐雪[39]表明，模擬糖尿病的HG無(wú)血清狀態(tài)，可使BMSCs的旁分泌因子減少，進(jìn)而影響其遷移能力。這些研究都表明HG可以抑制BMSCs的定向遷移，限制BMSCs向骨受損區(qū)募集，進(jìn)而影響骨代謝的過(guò)程。然而有學(xué)者[40]表示，HG可促進(jìn)人BMSCs的遷移。

2.7 HG影響B(tài)MSCs的旁分泌功能

研究發(fā)現(xiàn)在外界微環(huán)境刺激下，BMSCs可以通過(guò)旁分泌多種生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨修復(fù)和再生。這些生長(zhǎng)因子包括胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1，TG-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等可以影響成骨細(xì)胞活性，從而使BMSCs參與骨重建與血管形成的耦合過(guò)程以修復(fù)骨缺損[41-42]。王廣闊等[43]研究認(rèn)為，BMSCs可以通過(guò)旁分泌作用使成骨相關(guān)基因Osterix、Runx2、OPN表達(dá)上調(diào)，從而提高成骨細(xì)胞成骨活性，也會(huì)使成骨細(xì)胞遷移相關(guān)基因MMP-2、MMP-9表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞趨化遷移到骨損傷部位，此外，BMSCs旁分泌作用還能增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖能力、成骨礦化能力。然而，在HG環(huán)境下，BMSCs的旁分泌作用被抑制[44-45]。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

BMSCs的生物活性與功能特性與DOP的發(fā)生、發(fā)展及治療均有著密不可分的聯(lián)系。研究HG對(duì)BMSCs的影響作用，既可以深入了解DOP的發(fā)病機(jī)制，又可以為干細(xì)胞療法發(fā)揮更優(yōu)效益提供理論支持。綜上所述，HG對(duì)BMSCs的作用存在雙向性，一方面，在HG環(huán)境下，BMSCs會(huì)加速凋亡、鐵死亡及成脂向分化，而減緩旁分泌及成血管向分化，進(jìn)而抑制成骨；另一方面，HG通過(guò)促進(jìn)BMSCs及線粒體自噬，保存細(xì)胞活性，一定程度上會(huì)促進(jìn)成骨。在BMSCs增殖方面，HG對(duì)不同來(lái)源的細(xì)胞系有不同作用傾向，但一般認(rèn)為，短暫HG會(huì)促進(jìn)BMSCs增殖，持續(xù)HG會(huì)抑制BMSCs增殖。此外，HG對(duì)BMSCs定向遷移也有不同的作用傾向，但大部分研究表明，HG會(huì)抑制其定向遷移能力。

雖然越來(lái)越多的學(xué)者通過(guò)研究HG對(duì)BMSCs的影響來(lái)間接為DOP的治療提供實(shí)驗(yàn)論據(jù)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。而且，基礎(chǔ)與臨床研究均證明，DOP患者的BMSCs并非單純處于HG環(huán)境下，其鐵、脂、激素、蛋白質(zhì)水平均處于異常狀態(tài)，因此，HG對(duì)BMSCs的影響與其它物質(zhì)代謝之間又具有一定的聯(lián)系，并且是交互影響的，存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，故對(duì)DOP的理論認(rèn)識(shí)仍需要日益更新。