黃濤 方紅育 周少懷 卞峰 任敏 李宏亮 俞詩(shī)威 嚴(yán)錦曦 錢慧 李嘉瓊

武漢市第三醫(yī)院骨一科，湖北 武漢 430060

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以炎癥反應(yīng)、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞減少和軟骨基質(zhì)丟失為特征的關(guān)節(jié)退行性疾病[1]。軟骨細(xì)胞的凋亡增加和過度炎癥反應(yīng)有助于軟骨降解[2]。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是關(guān)節(jié)炎癥后出現(xiàn)的主要細(xì)胞因子，參與OA軟骨細(xì)胞功能障礙，被廣泛用于體外OA模型的建立[3-4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄因子(X inactive specific transcript，XIST)被報(bào)道為肺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的癌基因[5-6]。有證據(jù)證實(shí)XIST通過吸附miR-302a-3p促進(jìn)原發(fā)性韌帶成纖維細(xì)胞成骨分化[7]。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)被生物信息學(xué)預(yù)測(cè)為miR-302a-3p的靶基因，有報(bào)道[8]稱PDK1在OA患者軟骨組織中上調(diào)。但在OA中XIST和miR-302a-3p的相互作用及其與PDK1的作用并不明確。因此本研究采用IL-1β刺激軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)模擬體外OA環(huán)境，探討XIST、miR-302a-3p在OA細(xì)胞模型中的功能和調(diào)控機(jī)制，為OA的發(fā)病機(jī)制提供新的見解。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM購(gòu)自北京諾博萊德公司；XIST的小干擾RNA(si-XIST)和過表達(dá)載體(pc-XIST)、miR-302a-3p模擬物(miR-302a-3p mimics)和抑制劑(miR-302a-3p inhibitor)及相應(yīng)的陰性對(duì)照(si-NC、pcDNA、miR-NC mimics和miR-NC inhibitor)購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；IL-1β購(gòu)自北京同立海源生物公司；Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)英杰公司；Trizol試劑購(gòu)自上海生工生物公司；TB Green Premix Ex Taq II Kit購(gòu)自大連寶生物公司；MTT試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒購(gòu)自上海銳賽生物公司；Bcl-2、Bax、PDK1、GAPDH一抗及其二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自上海伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和IL-1β誘導(dǎo)：從青旗(上海)生物公司購(gòu)買人軟骨肉瘤細(xì)胞系SW1353后，使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。然后用濃度為10 ng/mL的重組人IL-1β處理SW1353細(xì)胞24 h，刺激細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而在體外模擬OA樣軟骨細(xì)胞損傷[9]。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染：使用Lipofectamine 3000將1.1中的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SW1353細(xì)胞后再用IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞，將其記為IL-1β+si-NC組、IL-1β+si-XIST組、IL-1β+si-PDK1組、IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor組、IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor組，僅用10 ng/mL IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞記為IL-1β組，未經(jīng)任何處理的細(xì)胞記為Control組。

1.2.3qRT-PCR實(shí)驗(yàn)：使用Trizol試劑從各組SW1353細(xì)胞中提取總RNA。將2 μg定量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后按照生產(chǎn)說明書用TB Green Premix Ex Taq II Kit進(jìn)行PCR擴(kuò)增。相對(duì)表達(dá)分析通過2-ΔΔCt法進(jìn)行。使用GAPDH對(duì)TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、XIST或PDK1的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用U6對(duì)miR-302a-3p進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力：SW1353細(xì)胞(2×103個(gè)/孔)接種于96孔板過夜。然后加入20 μL MTT孵育4 h，然后加入200 μL/孔的DMSO孵育10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下的吸光度。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染后的SW1353細(xì)胞用PBS洗滌并暴露于胰蛋白酶溶液中。2 000 r/min離心8 min后在300 μL結(jié)合緩沖液中重懸。將細(xì)胞懸液與5 μL Annexin V-FITC在25 ℃避光混合15 min后，用2.5 μL PI孵育約5 min，流式細(xì)胞儀觀察凋亡細(xì)胞。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-302a-3p與XIST或PDK1的靶向關(guān)系：ENCORI和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)miR-302a-3p與XIST或PDK1的假設(shè)結(jié)合位點(diǎn)。通過分子克隆將XIST和PDK1 3’ UTR的cDNA序列及其突變序列分別插入pmirGLO報(bào)告載體，生成野生型(WT-XIST和WT-PDK1)和突變型(MUT-XIST和MUT-PDK1)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。24孔板中IL-1β處理過的SW1353細(xì)胞與這些重組質(zhì)粒和miR-302a-3p mimics或miR-NC mimics共轉(zhuǎn)染。48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)評(píng)估熒光素酶活性。

1.2.7免疫印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax及PDK1表達(dá)：用SDS-PAGE分離從各組SW1353細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后在脫脂牛奶中進(jìn)行非特異性信號(hào)阻斷和一抗(anti-Bcl-2、anti-Bax、anti-PDK1和anti-GAPDH)培養(yǎng)。然后將二抗在室溫下孵育至膜上1 h，最后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行免疫印跡，用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 XIST和miR-302a-3p在IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞中的表達(dá)

與Control組[(1.00±0.03)、(1.00±0.03)]比較，IL-1β組SW1353細(xì)胞中XIST表達(dá)(3.39±0.21)升高，miR-302a-3p表達(dá)(0.41±0.01)降低(P<0.05)。

2.2 敲低XIST對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與Control組相比，IL-1β組XIST表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞活力、Bcl-2表達(dá)下降，凋亡率、Bax表達(dá)增加(P<0.05)；與IL-1β組和IL-1β+si-NC組相比，IL-1β+si-XIST組XIST表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞活力、Bcl-2表達(dá)升高，凋亡率、Bax表達(dá)下降(P<0.05)，見圖1、圖2和表3。

表3 敲低XIST對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞增殖、凋亡的影響Table 3 Effects of knockdown of XIST on the proliferation and apoptosis of SW1353 cells induced by IL-1β n=6)

圖1 敲低XIST對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effects of knockdown of XIST on IL-1β-induced apoptosis in SW1353 cells

注：A：Control組；B：IL-1β組；C：IL-1β+si-NC組，D：IL-1β+si-XIST組。

2.3 敲低XIST或PDK1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞炎癥因子的影響

與Control組相比，IL-1β組TNF-α、IL-1β、IL-6水平增加，IL-4、IL-10水平減小(P<0.05)；與IL-1β組和IL-1β+si-NC組相比，IL-1β+si-XIST組和IL-1β+si-PDK1組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，IL-4、IL-10水平升高(P<0.05)，見表4。

表4 敲低XIST或PDK1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞炎癥因子的影響Table 4 Effects of knockdown of XIST or PDK1 on IL-1β-induced inflammatory factors in SW1353 cells n=6)

2.4 XIST負(fù)向調(diào)控miR-302a-3p

ENCORI預(yù)測(cè)顯示miR-302a-3p與XIST存在作用位點(diǎn)，見圖3。miR-302a-3p mimics+WT-XIST組相對(duì)熒光素酶活性顯著低于miR-NC mimics+WT-XIST組(P<0.05)，見表5。pc-XIST組miR-302a-3p表達(dá)低于pcDNA組，si-XIST組miR-302a-3p表達(dá)高于si-NC組(P<0.05)，見表6。

圖3 miR-302a-3p與XIST的作用位點(diǎn)Fig.3 Interaction site between miR-302a-3p and XIST

表5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

表6 XIST負(fù)向調(diào)控Table 6 XIST negatively regulates miR-302a-3p n=6)

2.5 miR-302a-3p的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了si-XIST對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞的作用

與IL-1β+si-XIST組和IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor組比較，IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor組miR-302a-3p表達(dá)下降，細(xì)胞活力、Bcl-2表達(dá)及IL-4、IL-10水平降低，凋亡率、Bax表達(dá)及TNF-α、IL-1β、IL-6水平上升(P<0.05)，見圖4、圖5、表7、表8。

表7 miR-302a-3p的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了si-XIST對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞增殖、凋亡的作用

表8 miR-302a-3p的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了si-XIST對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞炎癥因子的作用

注：A：IL-1β+si-XIST組；B：IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor組；C：IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor組。

2.6 PDK1是miR-302a-3p的靶點(diǎn)

圖6顯示，Targetscan預(yù)測(cè)顯示miR-302a-3p與PDK1可能存在作用關(guān)系。miR-302a-3p mimics+WT-PDK1組相對(duì)熒光素酶活性明顯低于miR-NC mimics+WT-PDK1組(P<0.05)，見表9。miR-302a-3p mimics組PDK1 mRNA和蛋白表達(dá)低于miR-NC mimics組，miR-302a-3p inhibitor組PDK1 mRNA和蛋白表達(dá)高于miR-NC inhibitor組(P<0.05)，見圖7和表10。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖6 miR-302a-3p與PDK1的作用位點(diǎn)Fig.6 The interaction sites of miR-302a-3p and PDK1

注：A：miR-NC mimics組；B：miR-302a-3p mimics組；C：miR-NC inhibitor組，D：miR-302a-3p inhibitor。

表9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)Table 9 Dual-luciferase reporter gene assay n=6)

表10 miR-302a-3p靶向調(diào)控

2.7 XIST敲低通過促進(jìn)miR-302a-3p抑制PDK1的表達(dá)

IL-1β組PDK1 mRNA和蛋白表達(dá)比Control組高(P<0.05)；IL-1β+si-XIST組PDK1 mRNA和蛋白表達(dá)比IL-1β組和IL-1β+si-NC組低(P<0.05)；IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor組PDK1 mRNA和蛋白表達(dá)比IL-1β+si-XIST組和IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor組高(P<0.05)，見圖8、表11。

注：A為Control組；B為IL-1β組；C為IL-1β+si-NC組；D為IL-1β+si-XIST組；E為IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor組；F：IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor組

表11 XIST敲低通過促進(jìn)miR-302a-3p抑制PDK1的表達(dá)

3 討論

lncRNA在OA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。例如，PVT1在OA患者血清中高表達(dá)，其缺失可減輕脂多糖誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[10]。Zhang等[11]通過調(diào)節(jié)miR-150-5p/AKT3促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)XIST在IL-1β處理的SW1353細(xì)胞中表達(dá)更高，提示XIST可能與OA的進(jìn)展有關(guān)。敲低XIST后細(xì)胞活力增強(qiáng)，凋亡受阻，提示IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可以通過下調(diào)XIST而得到緩解。過度炎癥在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中TNF-α、IL-6等促炎因子表達(dá)顯著升高[12]。結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)了SW1353細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，而XIST的敲低使細(xì)胞分泌的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，抗炎因子IL-4、IL-10水平升高，提示下調(diào)XIST可抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

研究[13-14]表明，XIST通過與miRNA作用發(fā)揮其調(diào)控功能。在本研究中，miR-302a-3p被證實(shí)為XIST的一個(gè)miRNA靶點(diǎn)，且XIST負(fù)向調(diào)控miR-302a-3p的表達(dá)。近期研究表明，miR-302a-3p不僅抑制多種癌癥的進(jìn)展，還在心、腦、腎等相關(guān)疾病中發(fā)揮作用。Bai等[15]指出，抑制miR-302a-3p可通過靶向抑制FMR1抑制缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。然而并未有報(bào)道顯示miR-302a-3p在OA中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-302a-3p在IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞中下調(diào)，而抑制miR-302a-3p可逆轉(zhuǎn)XIST敲除對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞凋亡、炎癥因子水平的影響，提示XIST敲除對(duì)軟骨細(xì)胞OA損傷的保護(hù)作用是通過促進(jìn)miR-302a-3p實(shí)現(xiàn)的。

作為上游的miRNA通過調(diào)控下游基因?qū)崿F(xiàn)其功能。在本研究中，Targetscan顯示了miR-302a-3p與PDK1 3’UTR序列的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。而雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)與qRT-PCR、Western blot聯(lián)合確定了PDK1是miR-302a-3p的下游靶基因。PDK1參與許多細(xì)胞系的凋亡，并控制了PI3K或其他途徑(如RAS GTPase-MAPK)下游的許多細(xì)胞過程[16]。同時(shí)，有報(bào)道[17]稱PDK1上調(diào)促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，PDK1在IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞中表達(dá)升高，由于既往研究[8]顯示了沉默PDK1可抑制體外模擬OA樣軟骨細(xì)胞凋亡，故本研究?jī)H檢測(cè)了其對(duì)炎癥因子的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默PDK1可降低促炎因子的分泌而增加抑炎因子的表達(dá)，說明PDK1能促進(jìn)OA進(jìn)展。此外，抑制miR-302a-3p可使XIST敲低對(duì)PDK1的抑制作用得到緩解，提示XIST在OA中的作用是通過miR-302a-3p/PDK1軸實(shí)現(xiàn)的。然而，PDK1能否挽救miR-302a-3p對(duì)OA的影響尚不清楚，這將是本研究接下來的重點(diǎn)。

綜上所述，抑制XIST通過靶向上調(diào)miR-302a-3p進(jìn)而抑制PDK1表達(dá)的作用促進(jìn)了IL-1β處理的軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活力，但抑制了凋亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這為XIST/miR-302a-3p/PDK1調(diào)控軸在OA進(jìn)展中的存在提供了證據(jù)，也在lncRNA領(lǐng)域中XIST作為一種有前途的分子生物標(biāo)志物為OA治療提供了新的方向。