向立麗,王 倩,蒙延娜,付春梅,段雅雅,馮 凱,李曉林
(徐州市中心醫(yī)院血液科,江蘇 徐州 221009)
植入綜合征(ES) 是造血干細胞移植(HSCT) 后中性粒細胞恢復早期的并發(fā)癥,是伴有免疫因素參與的一組臨床綜合征[1]。其臨床特征表現為發(fā)熱、皮疹、非心源性肺水腫、毛細血管滲漏綜合征、肝腎功能損害、體重增加等[1-2]。隨著異基因 HSCT的廣泛實施,ES 發(fā)生率升高至20%~68%[3-4]。研究發(fā)現,有多種血清細胞因子參與ES發(fā)病過程,其中包括白細胞介素-2(IL-2)、IL-6、IL-8、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等,但這些因子在急性移植物抗宿主病(aGVHD)的發(fā)病機制中也起著重要的作用[5-7],目前,尚缺乏確切的血漿生物學標志物可用于ES的早期診斷和療效評估。本研究采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測HSCT患者的血漿中多種細胞因子的變化,分析出ES患者特征性改變的細胞因子IL-4、IL-17,為早期快速判斷ES提供依據。
1.1研究對象 選取2017—2020年本科住院行異基因HSCT患者38例為研究組,年齡大于18~<68歲,包括急性白血病(AL)20例,骨髓增生異常綜合征(MDS)7例,重型再生障礙性貧血(SAA)11例。同時選取健康者20例為對照組。
1.2方法
1.2.1預處理方案 研究組AL患者采用白消安(Bu)+環(huán)磷酰胺(Cy)+抗胸腺細胞球蛋白(ATG)或依托泊苷(VP-16)+Bu+Cy+ATG方案治療,MDS患者采用地西他濱+Bu+Cy+ATG方案治療,SAA患者采用氟達拉濱(Flu)+Cy+ATG方案治療。對發(fā)生ES的患者,停用細胞生長因子,給予糖皮質激素治療[甲潑尼龍1~2 mg/(kg·d),在癥狀好轉后迅速減量],較重者輔以補充白蛋白、羥乙基淀粉擴容及改善毛細血管通透性,并予利尿對癥治療。所有患者于移植前(回輸干細胞前)、移植后10 d及發(fā)生ES時、發(fā)生aGVHD時采集外周血血漿標本用于檢測。發(fā)生ES的患者于治療好轉后再次采集外周血樣本。收集對照組對象晨起空腹外周血血漿樣本。兩組標本采集時均獲得患者知情同意。
1.2.2ES診斷標準[1]滿足3條主要標準或2條主要標準加1條及以上次要標準確診ES。(1)主要標準:①體溫大于或等于38.5 ℃,無確定的感染灶;②彌漫性肺浸潤的非心源性肺水腫及缺氧癥狀;③非藥物性紅斑性皮疹,累及全身皮膚25%以上。(2)次要標準:①體重增加大于或等于基礎體重的2.5%;②腎功能不全,肌酐大于或等于2倍基值以上;③肝功能異常,總膽紅素大于或等于34 μmol/L或轉氨酶大于或等于2倍基值以上;④不能用其他原因解釋的一過性腦病。
1.2.3檢測方法 檢測前先將患者樣本進行處理,按照ELISA試劑盒說明書完成工作液和標準液配置,向每個孔中加入 100 μL血漿樣本和50 μL工作抗體,隨后將平板密封并在搖床上室溫孵育1 h。孵育完成后用wash buffer洗滌每個孔3次,最后1次洗滌后將平板翻轉并在干凈的吸水紙上扣去多余的液體。然后在每個孔中加入100 μL TMB底物,放在搖床上避光孵育10 min后立即加入100 μL 終止液終止顯色反應,在搖床上晃動工作板 1 min 混合均勻后,立即使用酶標儀記錄 450 nm處的光密度(OD)值,用于后續(xù)計算。人IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和IFN-α ELISA 試劑盒均購自英國Abcam公司,酶標儀型號為 SpectraMax Paradigm,購自美國 SpectraMax 公司。
2.1研究組患者HSCT后細胞因子水平變化 研究組38例患者HSCT后有9例發(fā)生ES,13例發(fā)生aGVHD,16例未發(fā)生ES及aGVHD。與aGVHD組、無ES及aGVHD組比較,發(fā)生ES組患者血漿IL-4、IL-17水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。其余細胞因子水平比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
A.IL-4;B.IL-17;與無ES及aGVHD組、aGVHD組比較,aP<0.05。圖1研究組患者HSCT后血漿IL-4和IL-17水平變化
2.2研究組患者HSCT前與對照組血漿IL-4、IL-17水平比較 與對照組比較,研究組患者移植前血漿IL-4水平[(5.19±0.62)pg/mLvs.(4.78±0.92)pg/mL]和IL-17水平[(11.37±1.24)pg/mLvs.(10.43±1.06)pg/mL]無明顯升高,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
2.3ES患者HSCT前后IL-4、IL-17水平變化 HSCT后,ES患者IL-4、IL-17水平較HSCT前顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.012、0.009)。經過治療好轉后,ES患者IL-4、IL-17水平較發(fā)生ES時下降,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.023、0.003),與移植前比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.168、0.483),見表1。
表1 ES患者HSCT前后及治療后IL-4、IL-17水平變化
2.4ES患者與無ES患者HSCT后10 d血漿IL-4、IL-17水平比較 9例患者發(fā)生ES(ES發(fā)生時間為12~20 d,持續(xù)時間為3~10 d),16例患者未發(fā)生ES。與無ES組比較,ES組患者HSCT后10 d血漿IL-4、IL-17水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.016、0.005),見表2。
表2 ES患者與無ES患者HSCT后10 d血漿IL-4、IL-17水平比較
2.5血漿IL-4、IL-17診斷ES的ROC曲線 通過比較未發(fā)生ES組與發(fā)生ES組HSCT后10 d的數據繪制ROC曲線,以ROC曲線及其曲線下面積作為某一診斷方法準確性評價的指標,ROC曲線下面積越大,診斷價值越高。IL-4診斷ES曲線下面積為(0.947±0.024)[95%置信區(qū)間(95%CI) 0.900~0.994,P<0.05],特異度和敏感度分別為0.93%、0.72%,截點概率為1.750。IL-17診斷ES曲線下面積為(0.853±0.056)(95%CI0.799~0.912,P<0.05),特異度和敏感度分別為0.83%、0.75%,截點概率為0.580。IL-4+IL-17診斷ES曲線下面積為(0.896±0.031)(95%CI0.875~0.929,P<0.05),特異度和敏感度分別為0.90%、0.73%,截點概率為1.240。說明血漿IL-4和IL-17評估ES的診斷價值均高,而IL-4的診斷價值最高。見圖2。
圖2 血漿IL-4、IL-17診斷ES的ROC曲線
ES多發(fā)生在HSCT后4~22 d,白細胞升高5 d內[8-9],伴隨中性粒細胞恢復。目前獨立于 GVHD發(fā)生的 ES 越來越常見[10]。在異基因HSCT中,ES與aGVHD臨床表現相似,沒有本質區(qū)別,目前主要從發(fā)生時間、臨床特征、皮膚活檢和細胞因子幾方面進行鑒別[11]。LAWRENCE 等[12]報道HSCT后發(fā)生ES提示預后差。因此,早期快速識別ES并及時干預治療有助于改善患者預后。血漿細胞因子水平檢測方便快捷、耗時短,并且能隨時動態(tài)監(jiān)測其變化,可鑒別診斷ES和aGVHD,對ES早期診斷及療效評估具有臨床應用價值,而目前與ES相關的特異性細胞因子尚缺乏報道。SHAN等[13]研究了兒童干細胞移植后ES中降鈣素原(PCT)和細胞因子變化,結果顯示PCT升高可作為ES的生物標志物。KHANDELWAL等[14]對兒童HSCT受者發(fā)生ES時細胞因子譜進行了分析,發(fā)現與單獨aGVHD患者相比,單獨ES患者的血漿IL-1β、IL-6、IL-12、IL-4和IL-13水平顯著升高。本研究首先對38例接受異基因HSCT患者進行了包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和IFN-α 在內的12種細胞因子檢測,結果顯示9例發(fā)生ES患者的血漿IL-4和IL-17水平較發(fā)生aGVHD、未發(fā)生ES及aGVHD患者顯著升高,與無ES組患者比較,ES發(fā)生前即出現血漿IL-4和IL-17的水平升高,表明血漿IL-4和IL-17水平可作為ES的預測和診斷標志物。同時作者對IL-4和IL-17在ES患者中的診斷價值進行了評估。本研究中9例發(fā)生ES的患者臨床癥狀多出現在HSCT后12~20 d,而HSCT后10 d,ES組和無ES組血漿IL-4、IL-17水平均具有顯著差異。對血漿中IL-4、IL-17的水平進行ROC曲線分析,IL-4診斷ES曲線下面積為(0.947±0.024),特異度為0.93%,敏感度為0.72%;IL-17診斷ES曲線下面積為(0.853±0.056),特異度為0.83%,敏感度為0.75%;IL-4+IL-17診斷ES曲線下面積為(0.896±0.031),特異度為0.90%,敏感度為0.73%。說明IL-4和IL-17可以作為ES的診斷性指標,而IL-4診斷價值最高,但是IL-4+IL-17聯合診斷價值沒有單項IL-4指標有優(yōu)勢,考慮可能與IL-17的診斷價值偏低有關。
綜上所述,血漿IL-4、IL-17水平對評估ES具有較高的預測和早期診斷價值,為及時干預治療并改善患者預后提供依據。本研究病例數較少,但仍具有參考意義,可在臨床廣泛開展應用。