孫思雨，李 楠，丁?；?/p>

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233040；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，安徽 蚌埠 233000)

作為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑的他汀類(lèi)藥物(statins)，是臨床降脂的首選藥物，也是預(yù)防心腦血管疾病的重要藥物之一[1]。然而，他汀類(lèi)藥物的使用存在較大個(gè)體差異，部分患者會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)毒性、肝毒性、肌肉毒性、肝毒性及胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)[2]，因此為臨床醫(yī)生選擇個(gè)體化用藥和預(yù)后評(píng)估等方面帶來(lái)了很大的困擾。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物不良反應(yīng)與遺傳因素相關(guān)，尤其與有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(OATP1B1)編碼基因SLCO1B1及載脂蛋白E(APOE)基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)密切相關(guān)，SLCO1B1與APOE的不同基因型對(duì)藥物的療效及不良反應(yīng)差異較大[3]。進(jìn)行SLCO1B1與APOE基因檢測(cè)能夠幫助臨床醫(yī)生對(duì)患者實(shí)施個(gè)體化用藥指導(dǎo)，因此具有重要的診斷意義，并能提示他汀類(lèi)藥物不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究對(duì)蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的血脂異常患者進(jìn)行SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性位點(diǎn)分析，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-熒光探針?lè)?，以分子水平分析蚌埠及周邊地區(qū)SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性分布，可以防止心腦血管疾病的發(fā)生，為個(gè)體化治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年7—12月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診的血脂異常患者為研究對(duì)象。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡大于18歲患者；(2)患者血脂指標(biāo)：血清總膽固醇(TC)≥5.2 mmol/L，即大于200 mg/dL；或低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)≥3.4 mmol/L，即大于130 mg/dL；或高密度脂蛋白膽固醇小于1.0 mmol/L，即小于40 mg/dL；或甘油三酯大于或等于1.7 mmol/L，即大于200 mg/dL。(3)經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理專(zhuān)業(yè)委員會(huì)審查通過(guò)，患者簽署知情同意書(shū)。(4)長(zhǎng)期服用他汀類(lèi)藥物的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有嚴(yán)重心腦血管疾病和嚴(yán)重肝腎疾病的患者。經(jīng)篩選后共選取符合要求患者1 530例，采用PCR-探針?lè)▽?duì)SLCO1B1和 APOE基因進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)分析?；颊吣挲g30～95歲，其中男1 002例，女528例，平均年齡(67±16)歲。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑 SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?購(gòu)自武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司；核酸提取純化試劑盒購(gòu)自蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司；全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(型號(hào)：SLAN-48P)購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技公司；全自動(dòng)核酸提取儀(型號(hào)：NP968-C)購(gòu)自西安天隆科技公司；超凈工作臺(tái)(型號(hào)：SW-CJ-1D)購(gòu)自上海蘇凈公司；高速離心機(jī)(型號(hào)：TGL-16G)購(gòu)自江蘇新康醫(yī)療公司。

1.2.2核酸提取 收集1～2 mL紫色乙二胺四乙酸抗凝全血(無(wú)須空腹，可正常飲食，2～4 ℃冰箱保存，72 h內(nèi)處理)。按照核酸提取說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取核酸：在96孔預(yù)裝板的第1列和第7列先加入核酸釋放劑60 μL及蛋白酶K 16 μL,之后在第1列和第7列加入全血樣本200 μL，選擇全自動(dòng)核酸提取儀按照提取操作程序進(jìn)行核酸提取，運(yùn)行時(shí)間為48 min。運(yùn)行結(jié)束后，相應(yīng)第6列和第12列為對(duì)應(yīng)標(biāo)本DNA，用100 μL移液槍吸取75 μL核酸至1.5 mL EP管中。所提取的核酸用微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，核酸 A260/ A280在1.8～2.0，A260/A230>2。推薦定量濃度稀釋為5～15 ng/μL,要求核酸原液-20 ℃保存。

1.2.3PCR擴(kuò)增 SLCO1B1和APOE反應(yīng)體系：根據(jù)標(biāo)本數(shù)準(zhǔn)備好八聯(lián)管，先加入提取好的核酸2.4～2.6 μL，之后加入ApoE2、ApoE4、SLCO1B1*1b、SLCO1B1*5反應(yīng)液各21 μL，每個(gè)標(biāo)本加4個(gè)孔，同時(shí)做弱陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，蓋上PCR反管蓋，同時(shí)做好標(biāo)記，排除管內(nèi)多余氣泡并進(jìn)行渦旋混勻。先打開(kāi)全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)并檢查是否正常運(yùn)行，擴(kuò)增程序設(shè)置為40個(gè)循環(huán)：37 ℃ 10 min、95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s。將數(shù)據(jù)采集定在60 ℃，熒光信號(hào)收集為VIC通道(SLCO1B1*1b388G、SLCO1B1*5521C、ApoE2526T和ApoE4 388C)、FAM通道(SLCO1B1*1b388A、SLCO1B1*5521T、 ApoE2526 、ApoE4388T)和ROX通道(內(nèi)標(biāo)基因)。

1.2.4結(jié)果判斷 (1)樣本有效性的判定：內(nèi)標(biāo)基因(ROX通道)的Ct<38，擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。(2)樣本基因多態(tài)性判定：相應(yīng)通道的Ct<38，擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則該通道代表的基因型為陽(yáng)性。若Ct≥38或無(wú)Ct值，則該通道代表的基因型為陰性。(3)試劑盒有效性判定：①弱陽(yáng)性對(duì)照，F(xiàn)AM、VIC、ROX通道Ct≤32，擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期；②空白對(duì)照，F(xiàn)AM、VIC、ROX通道擴(kuò)增曲線為輕微斜線或直線，或無(wú)擴(kuò)增曲線，無(wú)明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，Ct≥38或無(wú)Ct值。(4)基因類(lèi)型判定：若僅ROX通道Ct<38，F(xiàn)AM通道無(wú)Ct值或Ct≥38，則判斷為純和突變型；若僅 FAM通道Ct<38，ROX通道無(wú)Ct 值或Ct≥38，則判斷為純和野生型；若ROX通道和FAM通道的Ct值均小于38，則判斷為雜合型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，然后分別計(jì)算基因型及基因頻率?；蛐图暗任换蝾l率與其他地區(qū)已報(bào)道數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1蚌埠及周邊地區(qū)患者APOE基因多態(tài)性分布 他汀類(lèi)用藥與APOE基因388T>C、526C>T 2個(gè)位點(diǎn)有關(guān)，APOE2和APOE4是APOE的檢測(cè)基點(diǎn)，可形成6種基因型及其所占比例分別為 0.52%(E2/E2)、14.12%(E2/E3)、1.96%(E2/E4)、67.12%(E3/E3)、15.10%(E3/E4)、1.18%(E4/E4)。其中APOE的療效正?；蛐?E2/E4 、E3/E3)組合最多，占比為69.08%，見(jiàn)表1。

表1 蚌埠及周邊地區(qū)患者SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性分布情況(n=1 530)

2.2蚌埠及周邊地區(qū)患者SLCO1B1基因多態(tài)性分布 他汀類(lèi)用藥與SLCO1B1基因388A>G、521T>C兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)，SLCO1B1*1b和SLCO1B1*5是SLCO1B1的檢測(cè)基點(diǎn)，可形成9種基因型，所占比例分別為4.90%(*1a/*1a)、30.13%(*1a/*1b)、36.60%(*1b/*1b)、0.59%(*1a/*5)、8.24%(*1a/*15)、17.32%(*1b/*15)、 0.26%(*5/*5)、 0.13%(*5/*15)、1.83%(*15/*15)。正常肌病風(fēng)險(xiǎn)患者占比為71.65%，中度肌病風(fēng)險(xiǎn)患者占比為26.15%，高度肌病風(fēng)險(xiǎn)患者占比2.22%，見(jiàn)表1。根據(jù)服用的藥物劑量與肌病的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生橫紋肌溶解癥可見(jiàn)，正常肌病風(fēng)險(xiǎn)基因型(*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b)組合最多，高度肌病風(fēng)險(xiǎn)患者肝臟攝取藥物能力較差，發(fā)生橫紋肌溶解癥，建議使用較低劑量他汀類(lèi)藥物；對(duì)于中度肌病風(fēng)險(xiǎn)患者，建議使用中等劑量他汀類(lèi)藥物。

2.3不同性別患者SLCO1B1基因多態(tài)性分布差異 男性患者的SLCO1B1各基因型所占比例分別為4.79%(*1a/*1a)、29.54%(*1a/*1b)、36.13%(*1b/*1b)、0.80%(*1a/*5)、8.68%(*1a/*15)、18.16%(*1b/*15)、0.30%(*5/*5)、0.20%(*5/*15)、1.40%(*15/*15)。正常肌病風(fēng)險(xiǎn)基因型占比為70.46%，占比最大；中度肌病風(fēng)險(xiǎn)占比為27.64%；高度肌病風(fēng)險(xiǎn)占比為1.90%。女性患者的SLCO1B1各基因型所占比例分別為5.11%(*1a/*1a)、30.87%(*1a/*1b)、37.88%(*1b/*1b)、0.19%(*1a/*5)、7.39%(*1a/*15)、15.72%(*1b/*15)、0.19%(*5/*5)、0(*5/*15)、2.65%(*15/*15)。正常肌病風(fēng)險(xiǎn)基因型占比為73.86%，占比最重；中度肌病風(fēng)險(xiǎn)占比為23.30%；高度肌病風(fēng)險(xiǎn)占比為2.84%。男女患者SLCO1B1各基因型占比比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同性別患者SLCO1B1基因多態(tài)性分布結(jié)果

2.4不同性別患者APOE基因多態(tài)性分布差異 男性患者APOE的各基因型所占比例分別為0.60%(E2/E2)、14.07%(E2/E3)、 2.10%(E2/E4)、66.96%(E3/E3)、15.07%(E3/E4)、1.20%(E4/E4)。療效正?；蛐驼急葹?9.06%，占比最大；療效較好基因型占比為14.67%；療效較差基因型占比為16.27%。女性患者APOE的各基因型所占比例分別為0.38%(E2/E2)、14.58%(E2/E3)、1.70%(E2/E4)、67.05%(E3/E3)、15.15%(E3/E4)、1.14%(E4/E4)。療效正?；蛐驼急葹?8.75%，占比最大；療效較好基因型占比為14.96%；療效較差基因型占比為16.29%。男女患者APOE各基因型占比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同性別患者SLCO1B1基因多態(tài)性分布結(jié)果

2.5蚌埠及周邊地區(qū)患者APOE基因型分布及等位基因頻率分布 1 530例患者中，APOE基因的388T>C位點(diǎn)檢測(cè)出野生型(TT)1 251例，純合突變型(CC)18例，雜合突變型(TC)261例，等位基因發(fā)生突變率為9.71%；APOE的526C>T位點(diǎn)共檢測(cè)出野生型(CC)1 276例，純合突變型(TT)8例，雜合突變型(CT)246例，等位基因發(fā)生突變率為8.56%。APOE的等位基因分布頻率與基因型見(jiàn)表2。

表2 蚌埠及周邊地區(qū)患者APOE基因型和等位基因分布頻率

2.6蚌埠及周邊地區(qū)患者SLCO1B1基因型分布及等位基因頻率分布 1 530例患者中，SLCO1B1基因的388A>G位點(diǎn)檢測(cè)出野生型(AA)88例，純合突變型(GG)853例，雜合突變型(AG)589例，等位基因發(fā)生突變率為75.00%；基因SLCO1B1的521T>C位點(diǎn)檢測(cè)出野生型(TT)1 096例，純合突變型(CC)34例，雜合突變型(TC)400例，等位基因突變發(fā)生率為15.29%。SLCO1B1的等位基因分布頻率與基因型見(jiàn)表3。

表3 蚌埠及周邊地區(qū)患者SLCO1B1基因型和等位基因分布頻率

采用χ2檢驗(yàn)，將本研究中基因型及等位基因頻率與其他地區(qū)已報(bào)道數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，論證SLCO1B1及APOE基因的上述多態(tài)性位點(diǎn)突變頻率觀察值符合Hardy-wenberg遺傳平衡(P>0.05)，具有群體代表性。

3 討 論

引起心腦血管疾病的主要原因是血脂異常，在我國(guó)人群中，因TC水平增高所導(dǎo)致的缺血性腦卒中事件發(fā)生率約為冠心病2倍以上，他汀類(lèi)藥物就成為臨床使用最為廣泛的降脂藥[4]，循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，他汀類(lèi)藥物降低LDL-C有明顯的個(gè)體差異(10%～70%)[5]，會(huì)引起相關(guān)不良反應(yīng)，如肌肉毒性、肝毒性、糖尿病和認(rèn)知功能改變等，因此基因多態(tài)性已成為影響他汀類(lèi)藥物降脂效果及不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的重要因素之一。

APOE基因存在于人體第19號(hào)染色體長(zhǎng)臂13區(qū)上[6]。機(jī)體脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)因子是APOE基因的388T>C、526C>T，是影響他汀類(lèi)降脂療效的主要因素，也是動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管病和高脂血癥的候選易感基因。APOE基因形成APOE2(388T-526T)、APOE3(388T-526C)、APOE4(388C-526C)3種單倍體和6種表型[7]。其中APOE3(388T-526C)為野生型，對(duì)機(jī)體正常生理功能發(fā)揮起重要作用。APOE2(388T-526T)為突變型，攜帶者血漿TC、LDL-C水平低于APOE3(388T-526C)型患者，他汀類(lèi)藥物降脂效果相對(duì)其他2型最好。APOE4(388C-526C)為突變型，與阿爾茲海默病(AD)、心腦血管病、冠心病、抑郁癥的高發(fā)性相關(guān)[8]，降脂療效往往不佳或無(wú)療效，TC、LDL-C水平均遠(yuǎn)高于APOE3型。

人類(lèi)的SLCO1B1基因存在于12號(hào)染色體上，SLCO1B1基因2種常見(jiàn)的單核苷酸多態(tài)性是388A>G、521T>C[9]。SLCO1B1基因可形成SLCO1B1*1a(388A-521T)、SLCO1B1*1b(388G-521T)、SLCO1B1*5(388A-521C)、SLCO1B1*15(388G-521C)4種單倍體和9種表型[10]。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽OATP1B1參與多種藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，在他汀類(lèi)藥物代謝中將血液中的藥物轉(zhuǎn)移至肝臟中，從而直接發(fā)揮藥效，是具有基因多態(tài)性的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[11]，OATP1B1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活力減弱是由突變型SLCO1B1基因引起，會(huì)增加肝毒性，導(dǎo)致肝臟攝取藥物能力降低，造成他汀類(lèi)藥物血藥濃度上升，加重橫紋肌溶解癥或肌病的風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，攜帶有*5位點(diǎn)與他汀性肌病的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，他汀類(lèi)藥物相關(guān)肌病的發(fā)生為劑量依賴性，目前臨床上已有相關(guān)病例報(bào)道攜帶SLCO1B1* 5等位基因是發(fā)生橫紋肌溶解癥的主要原因[12-13]。

蚌埠及周邊地區(qū)患者中APOE基因的E3/E3型1 027例，占比最大，為67.12%，表明他汀治療療效正常；老年癡呆、冠心病、腦梗死風(fēng)險(xiǎn)正常。SLCO1B1基因的*1a/*1b和*1b/*1b共1 021例，占比最大，為66.73%，則可以考慮使用較大劑量他汀。另外，APOE基因和SLCO1B1基因的各表型占比在男女患者之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同性別的APOE與 SLCO1B1 基因型分布符合人群總體分布趨勢(shì)。

蚌埠及周邊地區(qū)人群中APOE的E3/E4和E4/E4基因型患者共246例，占比為16.08%；從降脂效果看，他汀類(lèi)藥物療效較差，有增加冠心病、急性心肌梗死、腦梗死、老年癡呆風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)：攜帶1個(gè)E4基因患者的AD發(fā)病率為47%，而攜帶2個(gè)E4基因患者的AD發(fā)病率高達(dá)91%，并且，E4基因攜帶者的發(fā)病時(shí)間較非攜帶者提早10～20年[14]。所以，有AD家族史或記憶力已經(jīng)明顯衰退的人群需進(jìn)行APOE基因多態(tài)性檢測(cè)，因此要盡早干預(yù)高風(fēng)險(xiǎn)人群以延緩AD的發(fā)生，能更好地指導(dǎo)患者合理化用藥和健康生活。SLCO1B1基因的高度肌病風(fēng)險(xiǎn)患者共31例，占比為2.03%，此類(lèi)患者需要注意藥物使用劑量，使用阿托伐他汀降脂效果更好[15]。因此應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)關(guān)注心腦血管患者服用他汀類(lèi)藥物后的反應(yīng)，篩查APOE風(fēng)險(xiǎn)類(lèi)及SLCO1B1高度風(fēng)險(xiǎn)基因型不僅可以更好地指導(dǎo)臨床醫(yī)生用藥，還可以讓患者避免不良反應(yīng)和達(dá)到藥物治療的最大療效。

總之，SLCO1B1和APOE基因檢測(cè)能幫助臨床更合理地選擇藥物和劑量，制定個(gè)體化的降脂方案，最終使患者受益。