李 盈，楊新惠，馬志強(qiáng)，王 琪△

(1．石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832002；2．新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002)

百合科萱草屬植物萱草(HemerocallisfulvaL.)為民間傳統(tǒng)常用的中藥，在我國(guó)各地均有種植，其根、莖、葉、花，均可用來(lái)入藥[1]。在民間傳統(tǒng)用藥中，萱草常被用來(lái)安神醒腦、美顏養(yǎng)血、去熱解毒、通乳等[2]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)萱草具有抗腫瘤、抗菌、抗吸血蟲病、鎮(zhèn)靜催眠作用、抗抑郁、肝保護(hù)等藥理作用[3-5]。萱草花中含有多種生物活性物質(zhì)包括內(nèi)酰胺、類胡蘿卜素、甾體皂苷、蒽醌、黃酮類等[6]。其中黃酮類化合物具有較好的藥理活性[7]。黃紅焰等[8]發(fā)現(xiàn)萱草黃酮類成分具有顯著的降低血糖、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、改善動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)的作用。研究表明，萱草花總黃酮對(duì)大鼠肝纖維化具有改善作用，對(duì)乙醇所致小鼠急性酒精性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用[9-10]。還有研究表明，萱草花總黃銅可以減輕肝纖維化過(guò)程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少氧自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化物堆積進(jìn)而緩解肝纖維化，保護(hù)肝功能[11]。

研究萱草花中總黃酮提取工藝和分析檢測(cè)抗氧化成分有利于開發(fā)萱草花中總黃酮資源，可提升萱草花經(jīng)濟(jì)價(jià)值，避免造成資源浪費(fèi)[12]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)黃酮類化合物提取的方法眾多，包括傳統(tǒng)的提取方法如浸漬法、煎煮法、回流法、索氏提取法等，以及新方法主要包括超臨界流體萃取、超聲輔助提取、微波輔助提取、加壓液體提取、酶輔助提取等方法[13]。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)是一種有效的統(tǒng)計(jì)和優(yōu)化方法，與傳統(tǒng)的均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)相比，響應(yīng)面法具有試驗(yàn)精度高、試驗(yàn)次數(shù)少、數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)，且能反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[14]。本研究分別運(yùn)用加熱回流法和超聲輔助法提取總黃酮，在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)萱草花總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為該種植物的合理利用提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般材料 萱草干燥花2 kg，購(gòu)于新疆百草堂藥業(yè)集團(tuán)；無(wú)水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；蘆丁對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：081230)；其余化學(xué)試劑均為國(guó)藥集團(tuán)的分析純；亞硝酸鈉(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C11063391)；硝酸鋁(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10792299)；氫氧化鈉 (天津市鑫鉑特化工有限公司，批號(hào)：20200816)。

1.1.2器與試劑 FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；DZKW-0-2型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司、東京理化器械株獨(dú)資工廠)；V-2401PC型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；Sartorius BS110s型萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1對(duì)照品溶液配制[15]精密稱取2.5 mg干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品，置于25 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，混成濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.2待測(cè)溶液制備 稱取2.5 g萱草花粉末，按照提取條件加熱回流，減壓濃縮，濃縮液定容至25 mL，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的供試品溶液。

1.2.3萱草花類黃酮提取含量的測(cè)定

對(duì)人性和人的能力的平等主義和樂(lè)觀主義的看法恰恰也是陸九淵心學(xué)的重要思想特征。陸九淵自認(rèn)為傳承的是孟子的思想，孟子就曾說(shuō)過(guò)人皆可以為堯舜，在可以成為圣人這一點(diǎn)上，每個(gè)人沒(méi)有不同，而且都可以成為連孔子都景仰并且自愧不如的最高等的圣人。關(guān)于這種樂(lè)觀主義，陸九淵的表達(dá)更多。他十幾歲寫讀書筆記的時(shí)候就曾寫道“宇宙便是吾心，吾心便是宇宙”[3]，即，我之心、人之心與宇宙是合一的。類似的表達(dá)還有“心只是一個(gè)心，某之心，吾友之心，上而千百載圣賢之心，下而千百載復(fù)有一圣賢，其心亦只如此，心之體甚大”。[3]

1.2.3.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精確稱取5.34 mg蘆丁對(duì)照品于25 mL容量瓶中，70%乙醇溶解定容，吸取1.0 mL移入10 mL容量瓶中；加0.4 mL的5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，再加0.4 mL的10% AL(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min，最后加4 mL的4% NaOH溶液，70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置15 min，用紫外-可見分光光度計(jì)在200～800 nm內(nèi)全波長(zhǎng)掃描吸收曲線。觀察對(duì)照品溶液有最大吸收峰的地方，則以此作為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.3.2線性關(guān)系考察 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL容量瓶中，每個(gè)容量瓶中按照“1.2.3.1”項(xiàng)下方法加入顯色劑，以70%乙醇為空白，于最大吸收峰處測(cè)定其吸光度A，以蘆丁對(duì)照品溶液濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)得到公式。

供試品溶液按照步驟“1.2.3.1”進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定其吸光度A，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得濃度C，得出相應(yīng)的黃酮提取量。

1.2.3.3精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照步驟“1.2.3.2”測(cè)定其吸光度A，重復(fù)在同一條件下測(cè)定6次，根據(jù)吸光度A計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。

1.2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取總黃酮供試品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，按照步驟“1.2.3.2”分別于0、15、30、45、60、90 min測(cè)定吸光值A(chǔ)，計(jì)算RSD值。

1.2.3.5重復(fù)性試驗(yàn) 吸取6份總黃酮供試品溶液，各取0.5 mL于10 mL容量瓶中，按照步驟“1.2.3.2”測(cè)定吸光度A，計(jì)算RSD值。

1.2.3.6加樣回收率試驗(yàn) 分別精確量取9份已知吸光度的提取液于10 mL容量瓶中，分為3組，依次按照比例每組分別加入濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液 2.0、3.0、4.0 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的顯色方法，顯色定容，測(cè)定吸光度A，計(jì)算回收率與RSD值。

1.2.4.1提取溶劑濃度的篩選 精密稱取萱草花粉末5份，每份1.0 g，加入 20 mL不同濃度的乙醇(60%、 70%、80%、90%、100%)，每份樣品進(jìn)行1 h的加熱回流提取，趁熱過(guò)濾，減壓濃縮，按“1.2.3.2” 項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮被提取出的含量。

1.2.4.2提取時(shí)間的篩選 精密稱取萱草花粉末5份，每份1.0 g，加入20 mL 70%乙醇，分別加熱回流提取 30 、60 、90 、120 、150 min，趁熱過(guò)濾，減壓濃縮，按“1.2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮被提取出的含量。

1.2.4.3物料比的篩選 精密稱取萱草花粉末5份，每份1.0 g，分別按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)的物料比加入70%乙醇，水浴加熱回流提取，趁熱過(guò)濾，減壓濃縮，按“1.2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮被提取出的含量。

1.2.4.4提取次數(shù)的篩選 精密稱取萱草花粉末5份，每份1.0 g，分別加入70%乙醇，物料比1∶60(g/mL)，加熱回流提取60 min，并且分別提取1、2、3次，趁熱過(guò)濾，減壓濃縮，按“1.2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮被提取出的含量。

1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化萱草花總黃酮提取條件 根據(jù)前期的單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定提取次數(shù)，選取乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)和物料比(C)為自變量，以萱草花總黃酮提取量(Y)為響應(yīng)值，利用Design-Expert 10軟件中的Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)，優(yōu)化萱草花中總黃酮提取工藝。因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)因素水平及編碼表

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Design Experet 10.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1萱草花類黃酮提取含量測(cè)定結(jié)果

2.1.1測(cè)定波長(zhǎng)選擇 對(duì)照品溶液在510 nm處有最大吸收峰，故選用510 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2線性關(guān)系考察 最終確定曲線回歸方程為A=15.234C+0.013 1，R2=0.999 1，結(jié)果表明蘆丁在0.02～0.04 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度試驗(yàn) 計(jì)算出RSD值為 0.852%，表明此試驗(yàn)精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 計(jì)算出RSD值 為 1.571%，表明供試品溶液在1.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5重復(fù)性試驗(yàn) 計(jì)算出RSD值 為 0.388%，表明此方法重復(fù)性符合分析要求。

2.1.6加樣回收率試驗(yàn) 平均加樣回收率為97.41%，RSD值為1.01%。

2.2單因素試驗(yàn) 通過(guò)圖1可以明顯觀察出，當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，萱草花中總黃酮提取含量最高；如圖2所示，以70%乙醇提取，當(dāng)提取時(shí)間為90 min時(shí)，總黃酮提取出的含量最高；通過(guò)圖3可以看出，物料比為1∶60(g/mL)時(shí)，總黃酮含量最高；由圖4可知，分別提取 1、2、3 次，其中提取2次的總黃酮含量最高。

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

圖3 物料比對(duì)總黃酮提取量的影響

圖4 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取量的影響

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化萱草花總黃酮提取工藝結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 提取次數(shù)固定為2次，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

將表2中數(shù)據(jù)用 Design-Expert 10軟件進(jìn)行多元模擬擬合分析，得到以萱草花中總黃酮提取含量為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：Y=14.77+0.46A+0.016B-0.31C-0.23AB-0.25AC+0.82BC-1.81A2-0.44B2-1.44C2，方差分析見表3。

2.3.2兩兩因素交互作用分析 利用響應(yīng)面曲面圖來(lái)反映各因素之間的兩兩交互對(duì)萱草花中總黃酮提取含量的影響，通過(guò)軟件做了3個(gè)關(guān)鍵影響因素對(duì)萱草花中總黃酮提取含量交互影響的等高線圖及其曲面圖(圖5、6、7)，響應(yīng)值受曲線走勢(shì)影響，即越陡的曲線走勢(shì)，對(duì)總黃酮的提取含量影響越大；越平滑的曲線走勢(shì)，對(duì)總黃酮提取含量的影響越小。從等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著。乙醇濃度對(duì)總黃酮提取含量的影響較大，因?yàn)槠淝€趨勢(shì)較陡；物料比和提取時(shí)間對(duì)其影響較小，因?yàn)槠淝€趨勢(shì)較平緩。

圖5 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)萱草花總黃酮提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

2.3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert 10軟件分析計(jì)算得出的最佳提取條件為：乙醇濃度90%，提取時(shí)間90 min，物料比1∶60(g/mL)；選擇上述提取工藝，以相同方法提取3批樣品進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定從萱草花中提取出來(lái)的總黃酮提取量為14.87 mg/g。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可控。

3 討 論

總黃酮類化合物極性較小，易溶于極性較小的有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇等，本實(shí)驗(yàn)先采用加熱回流法對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、物料比及提取次數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，如圖1所示，隨著乙醇濃度的持續(xù)增大，萱草花中提取的總黃酮的含量增多，當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，萱草花中總黃酮提取含量最高，所以90%乙醇濃度為最佳濃度。如圖2所示，當(dāng)提取時(shí)間為90 min時(shí)，總黃酮提取出的含量最高，故選定90 min為最佳提取時(shí)間；通過(guò)圖3可以看出，物料比為1∶60(g/mL)時(shí)，總黃酮含量最高，因此1∶60(g/mL)為最佳物料比；由圖4可知，提取2次的總黃酮含量最高，因此選擇提取次數(shù)2次為最佳提取次數(shù)。

與其他分析方法相比，Box-Behnken 設(shè)計(jì)可以評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系，操作方便，條件預(yù)測(cè)性好，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響因素研究更全面，可靠性高。建立的模型能夠很好地預(yù)測(cè)出萱草花總黃酮提取量，預(yù)測(cè)值與實(shí)際提取量差異較小，可以應(yīng)用到其他藥材總黃酮提取工藝中。本實(shí)驗(yàn)采用紫外-分光光度法建立了萱草花總黃酮的提取量測(cè)定方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)。表3結(jié)果顯示，模型的擬合度值為0.000 6(P<0.01)，證明模型擬合度極顯著，可以理想地?cái)M合各因素對(duì)萱草花總黃酮提取量的影響結(jié)果，模型的失擬項(xiàng)為0.223 3(P>0.05)，代表失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明此模型的實(shí)驗(yàn)誤差相對(duì)較小。各因素影響強(qiáng)弱依次為：A>C>B。兩兩因素交互作用分析對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，如圖5、6、7所示，隨著溶劑濃度的持續(xù)增加，萱草花中總黃酮提取含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為90%，提取時(shí)間為90 min時(shí)，總黃酮被提取出的含量達(dá)到最大值。圖5響應(yīng)面的坡度趨勢(shì)較陡，等高線為橢圓形，結(jié)果表明，乙醇濃度與提取時(shí)間有很強(qiáng)的交互作用，乙醇濃度曲線比提取時(shí)間曲線更陡，說(shuō)明乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響大于提取時(shí)間(A>B)；圖6等高線近似圓形，說(shuō)明乙醇濃度與物料比交互作用較弱。圖7響應(yīng)面的坡度趨勢(shì)較陡，等高線為橢圓形，結(jié)果表明，提取時(shí)間與物料配比的交互作用較強(qiáng)。因此從響應(yīng)面的走勢(shì)程度可以看出，乙醇濃度對(duì)提取的總黃酮含量的影響最顯著，其次是物料比，最后是提取時(shí)間(A>C>B)，與方差分析結(jié)果一致。

圖6 乙醇濃度與物料比對(duì)萱草花總黃酮提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖7 提取時(shí)間與物料比對(duì)萱草花總黃酮提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

通過(guò)以上分析，認(rèn)為實(shí)驗(yàn)方法可靠，最終總黃酮最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度 90%、提取時(shí)間 90 min、物料比 1∶60 (g/mL)、提取2次，在此條件下，萱草花總黃酮提取量為14.87 mg/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值相符良好。本研究確定了萱草花總黃酮的提取工藝，并為企業(yè)進(jìn)一步有效開發(fā)萱草的提取利用、提高效率奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。