張 琪，劉軍紅

(寧夏大學(xué)新華學(xué)院，寧夏銀川 750000)

枸杞(L.)是傳統(tǒng)的中藥和保健食品，富含類胡蘿卜素、氨基酸、V、多酚、多糖、礦物質(zhì)等有效成分，具有滋養(yǎng)肝腎、降血糖、降低癌癥和延緩細(xì)胞衰老、提高免疫力等藥理功效。枸杞在采摘、貯藏過(guò)程中很容易發(fā)生褐變。鮮果枸杞果皮較薄，果實(shí)汁液較多，采摘、貯存、運(yùn)輸過(guò)程中都極易造成機(jī)械損傷，這為枸杞酶促褐變和微生物的侵入創(chuàng)造了有利條件，采后如不及時(shí)采取保鮮措施，很快就會(huì)發(fā)生酶促褐變。目前，枸杞主要以干制、酒類、飲料等產(chǎn)品形式出售，但在干制、榨汁過(guò)程中極易造成多糖、維生素、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分的損失，在一定程度上降低了枸杞的功效，且干果枸杞在加工及貯藏過(guò)程中也會(huì)發(fā)生褐變，影響品質(zhì)。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是催化酚類底物氧化的一組金屬蛋白酶，廣泛存在于多種植物中。PPO是引起枸杞酶促褐變的主要酶類，能夠催化底物生成褐色的醌類物質(zhì)，參與果蔬的酶促褐變反應(yīng)過(guò)程。枸杞貯藏過(guò)程鮮果保質(zhì)期短、干果營(yíng)養(yǎng)損失大的問題是目前枸杞資源開發(fā)利用的瓶頸，如何抑制PPO酶促褐變是解決枸杞鮮果貯藏的關(guān)鍵點(diǎn)。目前所采用的方法主要有物理法、化學(xué)抑制劑法、生物源保鮮法等，該研究簡(jiǎn)要梳理近年報(bào)道的枸杞多酚氧化酶相關(guān)研究，以期為枸杞酶促褐變基礎(chǔ)研究與應(yīng)用研究提供參考依據(jù)。

1 PPO的存在形式及褐變機(jī)理

在大多數(shù)果蔬中，PPO主要以結(jié)合態(tài)存在，且多少隨果蔬的成熟度的變化而改變。PPO是嚴(yán)格的質(zhì)體酶，主要分布在完整細(xì)胞的有色體、葉綠體和白色體等質(zhì)體中，底物分布在液泡中，正常情況下兩者分離，當(dāng)果蔬細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，分屬不同組織區(qū)域的PPO與酚類接觸，在氧氣的作用下催化酚類產(chǎn)生醌，醌自發(fā)聚合并與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)產(chǎn)生黑色或褐色物質(zhì)，從而發(fā)生酶促褐變。枸杞果中含有咖啡酸丁二酯、二咖啡?？鼘幩?、綠原酸等12中酚類物質(zhì)，其中綠原酸的含量最高。綠原酸是枸杞酶促褐變的主要底物之一，是導(dǎo)致枸杞酶促褐變的主要原因。

2 PPO的分子結(jié)構(gòu)

PPO的分子質(zhì)量范圍31～144 kD，且不同成熟期分子質(zhì)量不同。目前已知的PPO是四聚體蛋白酶，這種四聚體結(jié)構(gòu)依賴于所處的環(huán)境，當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變，這種四聚體會(huì)發(fā)生解離，因此，植物中的PPO通常以不同的分子形式存在。PPO是核編碼的氧化還原酶，其活性中心含有以Cu—Cu離子對(duì)形式緊密結(jié)合在一起的2個(gè)銅離子。圍繞2個(gè)銅離子形成了由3個(gè)組氨酸和1個(gè)半胱氨酸形成的CuA區(qū)域和由3或4個(gè)組氨酸形成的CuB區(qū)域，銅離子和硫通過(guò)共價(jià)鍵形成特殊的二硫銅復(fù)合物。PPO是在胞質(zhì)中合成的，在運(yùn)往質(zhì)體前還包含一個(gè)富含His的8～12 kD的信號(hào)肽。

3 不同抑制方法對(duì)枸杞中PPO活性的影響

物理法主要是通過(guò)溫度、pH、氣體成分、壓力等物理參數(shù)的改變延緩酶促褐變的發(fā)生。

溫度。溫度對(duì)PPO的活性有較大影響，高溫和低溫對(duì)PPO的活性都有抑制作用，其影響程度因果蔬的品種、部位而有所不同。枸杞PPO的最適溫度為36 ℃左右，不同品種的枸杞最適溫度略有差異。

研究證實(shí)，低溫能顯著抑制PPO的活性，緩解酶促褐變的發(fā)生。葛向珍等研究對(duì)比了低溫和常溫對(duì)去梗大果枸杞保鮮的影響，結(jié)果表明，低溫貯藏可以有效維持果實(shí)品質(zhì)。低溫貯藏的溫度控制在0 ℃與生物冰點(diǎn)溫度之間能更好地減少果實(shí)內(nèi)部水分的損失、降低酶活性，進(jìn)而保證果實(shí)的理化指標(biāo)、減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失、延長(zhǎng)枸杞的貯存期。低溫貯存條件下除了抑制PPO的活性，果實(shí)也能維持較高的活性氧清除能力、較好地保持細(xì)胞膜的完整性，從而抑制枸杞果實(shí)褐變的發(fā)生。同時(shí)低溫也會(huì)影響非酶促褐變的發(fā)生，抑制微生物的大量繁殖，抑制枸杞呼吸強(qiáng)度、果膠酶活性，減緩可滴定酸含量、過(guò)氧化物酶活性的下降和V含量的損失等，對(duì)保護(hù)枸杞果實(shí)的品質(zhì)有一定積極作用。

PPO并不是耐熱性的酶，因此通過(guò)高溫短時(shí)熱處理，可使其部分或全部不可逆地失活，從而抑制酶促褐變的發(fā)生。研究證實(shí)，70 ℃以上高溫處理可以有效抑制枸杞鮮果中PPO的活性，且溫度越高，完全抑制酶活性所用的時(shí)間越短。但過(guò)高溫度處理又會(huì)加快V等營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，因此，枸杞PPO的抑制宜采用高溫短時(shí)的熱處理方式。朱金霞等綜合考慮營(yíng)養(yǎng)成分等情況，推薦80 ℃熱處理3 min抑制枸杞酶促褐變。從加熱方式上，微波加熱及聲熱處理技術(shù)相較于傳統(tǒng)的熱傳導(dǎo)、熱對(duì)流及熱輻射滅酶效果要好。

pH。當(dāng)pH 3.0～8.0時(shí)，枸杞PPO的相對(duì)酶活性呈現(xiàn)雙峰型曲線。據(jù)此推斷枸杞中PPO可能具有同工酶或多種分子形式，劉威報(bào)道鮮果枸杞中PPO的最適pH為4.5，第2最適pH為7.0，且在酸性條件下活性相對(duì)較高。也有報(bào)道認(rèn)為，第2最適pH是因?yàn)镻PO是一種含銅的蛋白質(zhì)，其中的銅離子在不同的pH條件下有不同的解離度，從而出現(xiàn)雙峰型曲線。pH對(duì)PPO的影響在于改變酶表面的電荷影響其溶解度以及破壞其空間結(jié)構(gòu)。當(dāng)pH較低時(shí)，酶中的銅離子會(huì)被解離出來(lái)，使酶失活；當(dāng)pH較高時(shí)，銅離子則與酶蛋白脫離，生成Cu(OH)，使酶失活。

其他物理方法。除了傳統(tǒng)的溫度、pH外，近年來(lái)，也有一些其他物理方法應(yīng)用到枸杞PPO的抑制研究中。超高壓通過(guò)改變生物體內(nèi)大分子中的非共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)，能一定程度上鈍化某些酶類的活性，但枸杞中的PPO普遍都有較強(qiáng)的耐壓性。研究表明，枸杞鮮果在壓力325.77 MPa、溫度28.74 ℃條件下保持10.43 min，微生物殘存數(shù)量可以達(dá)到國(guó)家安全食品最低標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PPO的活性影響不顯著。黑果枸杞在300 MPa壓力下PPO的活性并沒有降低，而400 MPa以上高壓才能使PPO活性降低至0.5 U/mL。600 MPa保壓15 min，枸杞中的PPO仍然能保持一定的活性。高壓處理相對(duì)于殺滅微生物，引起枸杞褐變的主要酶類都具有較高的耐壓能力。僅靠高壓處理來(lái)徹底鈍化PPO，防止酶促褐變的效果不是很明顯，需結(jié)合其他手段(如溫度)來(lái)控制PPO活性。

氣調(diào)貯藏可以通過(guò)有效地降低果蔬的呼吸作用、蒸發(fā)作用和抑制微生物生長(zhǎng)，使得貯藏中的果蔬產(chǎn)品處于近類于休眠狀態(tài)，讓其正常的生理活動(dòng)降低至最低程度。Selcuk等在0 ℃下評(píng)價(jià)了主動(dòng)氣調(diào)對(duì)枸杞鮮果的保鮮效果，發(fā)現(xiàn)2%O+5%CO可以抑制PPO的活性。

化學(xué)試劑不僅影響PPO的活性，同時(shí)也會(huì)影響PPO的構(gòu)象。不同的化學(xué)試劑對(duì)于PPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響效果有著明顯差別。根據(jù)抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)抑制的方式，PPO抑制劑主要有金屬螯合劑、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、與氧化產(chǎn)物醌作用的還原劑、醌偶合劑、與酚類底物作用的化合物等。

金屬螯合劑。CaCl中的Ca可與PPO中的Cu競(jìng)爭(zhēng)，抑制PPO的活性。此外Ca還可與氨基酸反應(yīng)形成非水溶性化合物，從而減少非酶褐變的發(fā)生。通過(guò)研究2個(gè)品種的枸杞酶學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶液濃度1.2 mol/L時(shí)，枸杞PPO相對(duì)酶活性均降至10%以下，且相對(duì)酶活性均隨溶液濃度的增加而顯著降低，抑制效果明顯。因此，CaCl可作為枸杞鮮果PPO活性的優(yōu)良抑制劑。CaCl結(jié)合其他抑制因素對(duì)枸杞PPO活性的抑制效果有待進(jìn)一步研究。

競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。芳香族羧酸是PPO很好的抑制劑，對(duì)酶類底物芳香族羧酸起競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。水楊酸是一種簡(jiǎn)單的酚類化合物，被認(rèn)為是一種新的植物內(nèi)源激素，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老等多方面的生理調(diào)控。適量濃度的水楊酸處理能顯著降低果蔬PPO的活性，從而起到延緩果實(shí)褐變的作用。研究表明，1.0 mmol/L水楊酸處理能顯著降低PPO的活性。此外，不同濃度的水楊酸浸泡處理能顯著降低枸杞鮮果的腐爛率，延緩V的下降，提高過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性，降低PPO的活性，減緩細(xì)胞膜的損傷，延緩果實(shí)衰老，延長(zhǎng)鮮果貯存期。對(duì)其他果蔬的研究表明，水楊酸處理結(jié)合其他化學(xué)保鮮劑或者其他物理保鮮法效果更好，但復(fù)合處理對(duì)枸杞的處理效果目前沒有報(bào)道。

還原劑。該類化合物能夠和酚類的氧化產(chǎn)物醌作用，使醌還原為原來(lái)的底物，從而防止醌繼續(xù)反應(yīng)生成有色物質(zhì)，從而抑制酶促褐變的發(fā)生。

抗壞血酸既是有機(jī)酸，又是還原劑。它既可以作為醌的還原劑，將氧化的醌還原為酚類物質(zhì)，阻止醌類物質(zhì)進(jìn)一步自發(fā)聚合形成色素物質(zhì)，又可以作為酶分子中銅離子的螯合劑，降低PPO的活性，它甚至可以被PPO直接氧化，這樣又可以起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用。同時(shí)，抗壞血酸能降低環(huán)境的pH，抑制酶活性。抗壞血酸對(duì)酶促褐變的抑制效果取決它的濃度。朱金霞等研究發(fā)現(xiàn)，紅果枸杞和黃果枸杞鮮果的PPO活性均隨抗壞血酸溶液濃度的升高而降低，濃度為88.0 mmol/L可完全抑制黃果枸杞PPO相對(duì)酶活性。

與氧化產(chǎn)物醌作用的還原劑除抗壞血酸外，還有二氧化硫、亞硫酸鹽、巰基乙酸鹽等，但有些不宜用做食品添加，因此限制其在枸杞中的使用。

醌耦合劑。這類化合物能夠和醌作用，生成穩(wěn)定的無(wú)色化合物，防止第二步酶促反應(yīng)的繼續(xù)發(fā)生。同時(shí)，這類化合物還能導(dǎo)致蛋白酶含量的增加，從而分解PPO，也能起到防止褐變的作用。

L-半胱氨酸是一種天然含硫氨基酸，可與酶促反應(yīng)產(chǎn)物——醌類物質(zhì)結(jié)合生成硫氫化合物，從而抑制酶促褐變。研究表明，L-半胱氨酸在較低濃度時(shí)就能較好地抑制鮮果枸杞PPO的活性，0.024 mmol/L時(shí)可完全抑制PPO的活性，可以作為首選抑制劑。

天然抑制劑具有安全、無(wú)毒、無(wú)殘留的優(yōu)勢(shì)。具有PPO抑制作用的天然抑制劑主要有黃酮類、醛類、糖苷類、苯丙素類及真菌代謝物類，這些提取物中的抗氧化物可以保護(hù)枸杞中的酚類物質(zhì)不被氧化。趙榮祥等研究了花椒、藿香、荷葉、丁香、丹參等18種植物提取物對(duì)PPO的抑制效果，結(jié)果表明，18種提取物均對(duì)鮮果枸杞的PPO活性有一定的抑制效果，其中以荷葉乙醇提取物和檸檬油提取物的抑制效果最為明顯。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑通過(guò)抑制PPO酶的活性或抑制抗壞血酸的下降及調(diào)節(jié)乙烯含量從而達(dá)到抑制酶促褐變的作用。

1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)能與乙烯受體結(jié)合，阻斷乙烯信號(hào)傳導(dǎo)，能較好地保持果實(shí)的完整性。赤霉素可降低PPO的生物合成以減少采后褐變。適當(dāng)濃度的ClO可以阻止蛋氨酸分解為乙烯，且破壞已經(jīng)形成的乙烯，抑制果實(shí)的衰老，對(duì)延緩枸杞鮮果的衰老有一定作用。ClO也能抑制V氧化酶的活性，減少V的損失。NO通過(guò)影響植物內(nèi)部乙烯合成和內(nèi)部NO代謝延緩果蔬衰老進(jìn)程。NO能抑制細(xì)胞色素C氧化酶活性、線粒體呼吸鏈上復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅱ，與氧可逆性競(jìng)爭(zhēng)而抑制呼吸鏈，導(dǎo)致線粒體產(chǎn)能過(guò)程受阻，從而抑制呼吸作用，延遲呼吸高峰的出現(xiàn)。NO熏蒸處理枸杞鮮果可顯著降低枸杞鮮果呼吸速率和果實(shí)腐爛率。NO處理能顯著抑制貯藏期枸杞PPO活性，有效降低果實(shí)的褐變度。同時(shí)，NO熏蒸可顯著抑制果實(shí)中抗壞血酸含量下降。

4 其他方法

酶促褐變的發(fā)生需要3個(gè)條件：底物(多酚類物質(zhì))、氧介質(zhì)、PPO。除了采用物理或化學(xué)方法抑制PPO活性外，隔絕空氣也可以延緩酶促褐變的發(fā)生。

玉米醇溶蛋白是一種從玉米蛋白粉中提取的天然高分子材料，具有良好的成膜性，將玉米醇溶蛋白與80%的乙醇溶液1∶10涂抹于鮮果枸杞表面，可以抑制氣體交換，降低呼吸速率，減少水分蒸發(fā)，防止微生物的大量生長(zhǎng)，更好地保持營(yíng)養(yǎng)成分和色澤。

殼聚糖是一種源自甲殼類動(dòng)物的外殼及菌類、藻類的陽(yáng)離子高分子多糖，噴涂于果實(shí)表面可形成一層透明的無(wú)色薄膜。該膜具有通透性、阻水性，對(duì)CO、CH和O有選擇透過(guò)性，可延長(zhǎng)果蔬貯藏保鮮時(shí)間。殼聚糖涂膜于鮮果枸杞，可一定程度抑制枸杞鮮果的腐爛和失水萎蔫，減緩V、可溶性固形物和可滴定酸含量的降低，保持果實(shí)良好的商品品質(zhì)，延長(zhǎng)保鮮期，其中以1.25%殼聚糖涂膜處理的枸杞鮮果的保鮮效果最佳。單一涂抹往往不能發(fā)揮最佳的保鮮效果，殼聚糖-山梨酸鉀復(fù)合涂抹保鮮效果更好。

5 展望

不同抑制劑的抑制機(jī)理各不相同，相對(duì)而言，復(fù)合處理效果更好。如采用不同溫度結(jié)合不同充氣包裝、殼聚糖結(jié)合山梨酸鉀涂膜保存、1-MCP結(jié)合氣調(diào)包裝和以NO浸泡處理等復(fù)合處理效果均好于單獨(dú)處理。

PPO的作用會(huì)導(dǎo)致枸杞的褐變，影響枸杞的品質(zhì)。長(zhǎng)期以來(lái)，枸杞的酶促褐變一直是影響枸杞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要制約因素。隨著人們對(duì)枸杞鮮果的需求不斷增加，有關(guān)枸杞PPO引起的褐變也逐漸受到重視，未來(lái)有關(guān)枸杞PPO的酶學(xué)特性和影響因子的研究也將更加深入。