蔣開(kāi)源，姚永波，劉紅梅

(1.邵陽(yáng)市中心醫(yī)院 神經(jīng)外科，湖南 邵陽(yáng)，422000;2.邵陽(yáng)市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖南 邵陽(yáng)，422000)

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，起源于神經(jīng)上皮組織[1]。其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)是惡性程度最高的膠質(zhì)瘤類型，屬WHO Ⅳ級(jí)，預(yù)后極差，中位生存時(shí)間為10～14個(gè)月[2]。手術(shù)聯(lián)合放化療是GBM的主要治療方法[3]，由于GBM呈高度浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，對(duì)放化療敏感性較差，復(fù)發(fā)成為臨床亟待解決的問(wèn)題。尋找有效抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)十分重要。

溶質(zhì)載體家族 6 成員 6 (SLC6A6)，也稱為牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一種高親和力、低容量和多通道膜蛋白，主要功能是以Na+和Cl-依賴的方式運(yùn)輸?；撬岷挺?丙氨酸。研究表明，SLC6A6在多種癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，與腫瘤不良預(yù)后關(guān)系密切[4-7]；并與化療藥物敏感性及多藥耐藥顯著相關(guān)[8]。SLC6A6調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境影響其免疫治療效果[9]。然而，SLC6A6在GBM中的作用及機(jī)制尚未清楚。本研究觀測(cè)SLC6A6 在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，分析其與膠質(zhì)瘤的關(guān)系，為尋找GBM發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物及治療新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃(CGGA,http://www.cgga.org.cn/)下載301例膠質(zhì)瘤患者mRNA表達(dá)譜和臨床病理信息及預(yù)后信息，其中285例有完整生存信息，包括性別、年齡、病理分級(jí)、IDH基因突變、MGMT基因啟動(dòng)子甲基化、生存時(shí)間及生存狀態(tài)。美國(guó)癌癥基因組圖譜計(jì)劃(TCGA，http://www.cancergenome.nih.gov/)GBM表達(dá)譜信息及生存信息從UCSC xena(https://xenabrowser.net/)中獲取，其中160例具有完整生存信息。

1.2 SLC6A6 mRNA表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床信息

將CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中285例具有完整生存信息的膠質(zhì)瘤患者按SLC6A6 mRNA表達(dá)中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析其與膠質(zhì)瘤患者臨床參數(shù)的關(guān)系。

1.3 SLC6A6 mRNA表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后

分別將CGGA和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者的SLC6A6 mRNA中位表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析兩組患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 富集分析SLC6A6在GBM中的作用機(jī)制

(1)差異表達(dá)基因分析

按TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GBM的SLC6A6 mRNA中位表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用R包limma工具進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，差異表達(dá)基因(DEGs)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2FC|≥1 和P<0.05。

(2)GO和KEGG富集分析

將獲取的DEGs通過(guò)DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體論分析(gene ontology，GO)，包括：生物學(xué)途徑(biological process，BP)、細(xì)胞組(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)以及通路注釋及富集分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SLC6A6表達(dá)與膠質(zhì)瘤相關(guān)性

SLC6A6表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)及IDH基因突變顯著相關(guān)(P<0.05)(圖1)。GBM SLC6A6高表達(dá)比例(56.9%)較低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者(43.4%)高，在IDH基因野生型腫瘤SLC6A6高表達(dá)比例(55.4%)較突變型患者(43.3%)高(表1)。SLC6A6表達(dá)與性別、年齡及MGMT基因啟動(dòng)子甲基化無(wú)顯著相關(guān)。SLC6A6在GBM中顯著高表達(dá)(P<0.001)。在IDH突變型中，SLC6A6表達(dá)水平較低(P<0.001)，見(jiàn)圖1。

圖1 CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中SLC6A6表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)(a)及IDH基因突變(b)的關(guān)系Fig.1 The relationship between SLC6A6 expression and glioma pathological grade (a) and IDH gene mutation (b) in CGGA database

表1 CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中SLC6A6表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 SLC6A6表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)性

分析CGGA 和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤SLC6A6表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系，結(jié)果顯示，CGGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤SLC6A6低表達(dá)和高表達(dá)總體生存時(shí)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)表2和圖2(a)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GBM SLC6A6低表達(dá)和高表達(dá)總體生存時(shí)間、無(wú)病進(jìn)展期差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2、圖2(b)和圖2(c)。

表2 CGGA和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中SLC6A6表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系

2.3 SLC6A6表達(dá)GO和KEGG富集分析

GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示：共有359個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中344個(gè)上調(diào)，15個(gè)下調(diào)，見(jiàn)圖3(a)和圖3(b)。GO功能富集分析表明，SLC6A6可能參與細(xì)胞黏附、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞間信號(hào)等生物學(xué)過(guò)程，見(jiàn)圖4(a)。參與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成、受體結(jié)合、整合素結(jié)合、細(xì)胞因子活性等分子功能，見(jiàn)圖4(c)?？赡苷{(diào)控細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、PI3K-Akt 信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、細(xì)胞黏附、ECM-受體相互作用和腫瘤壞死因子信號(hào)通路等信號(hào)通路，見(jiàn)圖4(d)。

圖2 CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)(a)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(b)、(c)中SLC6A6表達(dá)與膠質(zhì)瘤的Kaplan-Meier生存分析Fig.2 Kaplan-Meier survival analysis of SLC6A6 expression and glioma patients in the CGGA database (a) and TCGA database (b)，(c)

圖3 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GBM SLC6A6表達(dá)中位數(shù)分組的基因差異表達(dá)熱圖(a)和火山圖(b)Fig.3 Heatmap (a) and volcano plot (b) of differentially expressed genes (DEGs) grouped by the median expression of SLC6A6 in glioblastoma in the TCGA database

圖4 差異表達(dá)基因的GO(a、b、c)和KEGG(d)富集分析Fig.4 GO (a，b，c) and KEGG (d) enrichment analysis of DEGs

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)腫瘤之一，其中GBM是最威脅生命的類型，具有高度異質(zhì)性、生長(zhǎng)速度快、侵襲能力強(qiáng)、預(yù)后極差的特點(diǎn)，是最具有治療挑戰(zhàn)性的腫瘤之一。發(fā)病機(jī)制尚不明確，探索GBM發(fā)生發(fā)展的機(jī)制以及尋找治療靶點(diǎn)是亟待解決的問(wèn)題。

研究發(fā)現(xiàn)，SLC6A6在膠質(zhì)瘤中表達(dá)與病理分級(jí)及IDH基因突變有密切相關(guān)，在GBM的表達(dá)顯著高于膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅲ級(jí)組織，表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤預(yù)后顯著相關(guān)，因此，SLC6A6基因與GBM的發(fā)生發(fā)展有極大關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，SLC6A6在結(jié)直腸癌組織中顯著高表達(dá)，SLC6A6敲減降低了結(jié)直腸癌細(xì)胞的活性，提高了其對(duì)5-氟尿嘧啶 (5-FU)、多西環(huán)素 (doxycycline，DOX) 和 SN-38 的藥物敏感性，同時(shí)抑制了細(xì)胞的干性[8]。SLC6A6具有緊密連接蛋白相關(guān)分子特征，影響結(jié)直腸癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[10]，機(jī)制尚未闡明。SLC6A6可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞吸收δ-氨基乙酰丙酸 (δ-aminolevulinic acid，ALA)和5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolevulinic acid，5-ALA)，增強(qiáng)ALA誘導(dǎo)致癌細(xì)胞中原卟啉積累，從而發(fā)揮光動(dòng)力抗腫瘤治療作用[11-12]。SLC6A6在HPV陽(yáng)性宮頸癌組織中異常高表達(dá)，miR-3156-3p與之相反，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-3156-3p可靶向抑制SLC6A6表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌凋亡，抑制其增殖、遷移和血管生成[6]。

另一研究發(fā)現(xiàn)SLC6A6在胃癌組織中表達(dá)較高，低甲基化水平與SLC6A6表達(dá)水平顯著相關(guān)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[4]。LncRNA MIAT與HCC的腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)，與B細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，與PD-等免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)呈正相關(guān)；lncRNA MIAT可調(diào)控SLC6A6表達(dá)從而影響HCC的免疫微環(huán)境[9]。雖然上述研究提示SLC6A6在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但作用機(jī)制尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)SLC6A6在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)水平較高，在IDH基因野生型腫瘤中表達(dá)水平較高，原因尚未清楚。生存分析顯示SLC6A6表達(dá)水平越高，膠質(zhì)瘤預(yù)后越差，并且GBM無(wú)疾病進(jìn)展期越短，是膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的分子標(biāo)志物。

本研究的生物信息學(xué)功能富集分析表明，SLC6A6可能參與GBM細(xì)胞黏附、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程，可能調(diào)控細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、細(xì)胞黏附、ECM-受體相互作用和腫瘤壞死因子信號(hào)通路等和腫瘤發(fā)生、增殖和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路。由此推測(cè)，SLC6A6在GBM的疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起重要驅(qū)動(dòng)作用。

綜上所述，SLC6A6在膠質(zhì)瘤中表達(dá)與病理分級(jí)密切相關(guān)，可能與IDH基因突變相關(guān)，影響預(yù)后，并參與腫瘤發(fā)生發(fā)展信號(hào)通路調(diào)控。SLC6A6可能是GBM發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)，其作用及調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。