吳應(yīng)海李安定張麗敏彭熙蔡國(guó)俊張孫健

(1.貴州科學(xué)院山地資源研究所，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.貴州科學(xué)院生物研究所，貴州 貴陽(yáng) 550009)

百香果(Passiflora edulia)又名西番蓮、雞蛋果、洋石榴。是西番蓮科(Passifloraceae) 西番蓮屬(Passiflora L.)多年生半木質(zhì)化藤本植物，原產(chǎn)于南美洲，我國(guó)在20世紀(jì)80年代開(kāi)始引入臺(tái)灣、福建、廣東等地區(qū)種植，近年來(lái)作為貴州農(nóng)業(yè)特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，2020年百香果在貴州推廣面積達(dá)到了11666.67hm2，由于連續(xù)種植造成很多果園百香果病害頻發(fā)，這不僅對(duì)百香果產(chǎn)量造成巨大損失，還嚴(yán)重制約貴州百香果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展。

百香果莖基腐是百香果最主要病害，其病原菌主要是鐮刀菌(Fusarium sp.)，通常病菌以菌絲體在病株或土壤中越冬，翌年隨著氣溫逐步升高菌絲體逐步萌發(fā)，發(fā)病高峰期為每年5—7月，植株在苗期及成株期均可染病，主要危害部位為植株莖基部。幼苗染病后表現(xiàn)為葉片萎蔫脫落直到死亡，成株染病初期會(huì)在莖基部出現(xiàn)褐色病斑，接著病部皮層出現(xiàn)變軟腐爛，進(jìn)一步皮層與木質(zhì)部脫落，隨著病斑橫向擴(kuò)展環(huán)繞整個(gè)莖稈時(shí)，上部枝蔓及葉片出現(xiàn)黃化、萎蔫，直到病斑擴(kuò)展到根部導(dǎo)致整個(gè)植株死亡。在百香果種植過(guò)程中遇到高溫高濕、土壤偏酸、重茬、后期果園清理不干凈等情況非常容易感染莖基腐病，這對(duì)于最終產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益是一個(gè)不可忽視的的因素[1-3]。

研究植物抗病性是科學(xué)研究熱點(diǎn)，開(kāi)展植物抗病研究對(duì)于作物產(chǎn)量及品質(zhì)提高具有重要意義,也對(duì)植物及環(huán)境保護(hù)具有重要作用[4]。植物抗病性主要有形態(tài)結(jié)構(gòu)抗病及生理生化抗病性，結(jié)構(gòu)抗病主要通過(guò)植株特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)物理性抵御病原菌侵入。生理生化抗病是指植物體內(nèi)的一些防御酶，其中主要有POD、CAT、SOD、PPO、PAL等防御酶，這些防御酶含量不僅對(duì)于植物形態(tài)構(gòu)建具有重要意義，而且對(duì)于植物抗性具有重要決定作用[5]。這些酶活性高低直接影響著植物抗病性強(qiáng)弱，因此這些酶活性高低和峰值出現(xiàn)早晚可作為植物抗性水平和篩選抗病植物品種重要參考標(biāo)準(zhǔn)。本研究針對(duì)百香果不同品種莖基腐病抗性鑒定試驗(yàn)具有一定創(chuàng)新性，目前國(guó)內(nèi)研究較少，這對(duì)于后期開(kāi)展百香果莖基腐病預(yù)防與治理提供生理生化方面的理論依據(jù)，同時(shí)為百香果抗病砧木及抗病品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試百香果品種

本試驗(yàn)設(shè)在貴州科學(xué)院山地資源研究所產(chǎn)學(xué)研基地試驗(yàn)站，試驗(yàn)站位于貴州省平塘縣克度鎮(zhèn)，N106°48′14.23″，E25°43′48.05″，海拔891m。棚內(nèi)溫度控制在20～25℃，選用黃果品種(“黔黃1號(hào)”、“芭樂(lè)味黃金果”)；紫果品種(“貴寒1號(hào)”、“臺(tái)農(nóng)1號(hào)”、“紫香1號(hào)”)；綠皮品種(“綠皮荔枝味百香果”)，共6個(gè)品種為試驗(yàn)對(duì)象，每個(gè)品種選取30株長(zhǎng)勢(shì)基本一致，苗齡相同植株，采用盆栽14d后開(kāi)始莖基腐病菌接種試驗(yàn)(“貴寒1號(hào)”原代碼“平塘1號(hào)”)。

1.1.2 供試菌種

百香果莖基腐病菌：鐮刀菌(Fusarium sp.)，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保研究所蘭成忠老師團(tuán)隊(duì)分離、鑒定、保存供試。

1.2 方法

1.2.1 接種感病指數(shù)

1.2.1.1 葉片病菌接種

病菌接種葉片和莖基部為活體接種，采用活體針刺接種自然發(fā)病法[6]，種植14d后的百香果苗從頂端開(kāi)始選擇第2～4張成熟葉片作為接種葉片，葉片接種前用無(wú)菌脫脂棉蘸取75%酒精反復(fù)擦洗幾次，然后用無(wú)菌水擦洗3～5次。用滅菌解剖針在百香果葉片上以葉脈為中軸線兩邊各取3個(gè)接種點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)之間相距約2cm，每個(gè)品種接種10株，每株接種2片葉片(1片作實(shí)驗(yàn)組，1片作對(duì)照組),用解剖刀在25℃黑暗培養(yǎng)7d的百香果莖基腐病菌落菌絲0.5mm～1cm的菌塊貼于針刺處，用無(wú)菌PDA培養(yǎng)基作為接種對(duì)照。然后用沾有1%的葡萄糖水的脫脂棉覆于上面并用20cm×22cm的密封袋將整張接種的葉片密封起來(lái)，在控溫大棚中(22～25℃)中保濕72h后，逐日記錄菌斑大小。

1.2.1.2 莖基部病菌接種

每一試驗(yàn)品種選擇10株，在莖基部離地面5cm位置先用沾有75%的酒精脫脂棉反復(fù)擦洗，之后用沾有清水的脫脂棉擦洗干凈，并用已滅菌接種針在莖上環(huán)扎4孔，取25℃黑暗培養(yǎng)7d的百香果莖基腐病菌落菌絲0.5mm～1cm的菌塊貼于針刺處，用無(wú)菌PDA培養(yǎng)基作為接種對(duì)照。然后用沾有1%葡萄糖水的脫脂棉包裹困扎在上面。之后每隔7d觀察每1株的發(fā)病情況，并作記錄。

1.2.2 感病評(píng)價(jià)

葉片接種后每周調(diào)查記錄病斑擴(kuò)展情況，采用“十字交叉法”測(cè)量病斑直徑。感病指數(shù)[7-10]計(jì)算公式：

病害程度的分級(jí)根據(jù)病斑擴(kuò)展情況確定，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：病級(jí)Ⅰ，感病程度為病斑無(wú)擴(kuò)展；病級(jí)Ⅱ，感病程度為病斑1～3mm擴(kuò)展；病級(jí)Ⅲ，感病程度為病斑3.1～6.0mm擴(kuò)展；病級(jí)Ⅳ，感病程度為病斑6.1～9.0mm擴(kuò)展；病級(jí)Ⅴ，感病程度為病斑9.1mm以上擴(kuò)展。根據(jù)病斑指數(shù)計(jì)算結(jié)果，將抗病品種等級(jí)進(jìn)行劃分：感病指數(shù)1～35為高抗品種；感病指數(shù)36～45為中抗品種；感病指數(shù)在45以上為高感品種。

1.2.3 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

在接種病菌21d后進(jìn)行取樣，參照褚群和趙加欣等方法[11]測(cè)量不同處理株高、莖粗、根系鮮重、地上部分鮮重、根體積、根系干重、地上部分干重。

1.2.4 取材及樣品處理

選擇莖基部接種病菌植株作為試驗(yàn)取材對(duì)象，自嫩芽以下完全成熟葉片分別于接種0d、7d、14d、21d取樣，設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3株。將相同處理葉片放入有冰袋的樣品箱中，標(biāo)記后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室放置于-20℃冰箱中保存，用于防御酶活性測(cè)定。

1.2.5 測(cè)定的項(xiàng)目及方法

過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測(cè)定均由北京索萊寶科技有限公司提供的檢測(cè)試劑盒，試劑盒編號(hào)分別為BC0090、BC0200、BC0170、BC0190、BC0210。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WPS Office軟件、SPASS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種結(jié)果

接種尖孢鐮刀菌后10d測(cè)量菌斑大小，并取樣拍照，從圖1可以看出,6個(gè)百香果品種均不同程度感病，但感病最嚴(yán)重的是“綠皮荔枝味百香果”，見(jiàn)圖1f，感病最輕的是“黔黃1號(hào)”，見(jiàn)圖1a。

圖1 百香果不同品種接種病菌后的病斑生長(zhǎng)情況

如表1所示，供試的6個(gè)百香果品種接種鐮刀菌后，感病程度有很大差別，其中“綠皮荔枝味百香果”、“紫香1號(hào)”感病較重，病斑擴(kuò)展長(zhǎng)度較大，病斑分別為4.35mm、4.24mm，感病指數(shù)分別為59.72、56.53，為高感品種;其次是“臺(tái)農(nóng)1號(hào)”與“貴寒1號(hào)”，病斑為長(zhǎng)度分別為3.45mm、3.23mm，病情指數(shù)分別為45.83、40.28，為中抗品種；“黔黃1號(hào)”與“芭樂(lè)味黃金果”病斑較小，病斑長(zhǎng)度分別為2.15mm、2.43mm，感病指數(shù)分別為23.61、30.89，為高抗品種。感病指數(shù)最高是“綠皮荔枝味百香果”，最低是“黔黃1號(hào)”，而且兩者之間病斑長(zhǎng)度差異顯著，對(duì)接種感病后葉片病原再分離，獲得的病原菌與接種病原一致，對(duì)照處理葉片未發(fā)病。

表1 不同百香果品種接種病菌后感病結(jié)果

2.2 不同百香果品種接種莖基腐病菌對(duì)地上部分及地下部分的影響

如表2所示，對(duì)6種不同品種百香果莖基部接種鐮刀菌后21d，分別對(duì)株高、莖粗、根系鮮重、根系干重、地上部分鮮重、根系體積、地上部分干重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)考察指標(biāo)均低于對(duì)照組，這說(shuō)明接種鐮刀菌確實(shí)影響百香果的生長(zhǎng)。黃果品種各項(xiàng)測(cè)試數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組影響最小，其次是紫果品種，綠皮品種影響最大。

表2 不同百香果品種接種鐮刀菌后各項(xiàng)指標(biāo)變化

2.3 不同百香果品種接種莖基腐病菌后POD活性變化

過(guò)氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中其活性不斷發(fā)生變化，一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱，是植物體內(nèi)重要的活性氧清除劑。由圖2可知，接種后各百香果品種POD酶活性都出現(xiàn)了先上升后下降趨勢(shì)，黃果品種酶活性最高，酶活性分別是3.53U·g-1、2.93U·g-1，而且酶活性峰值出現(xiàn)較早，在接種病菌7d出現(xiàn)了峰值，其他百香果試驗(yàn)品種在接種14d出現(xiàn)峰值。

2.4 不同百香果品種接種莖基腐病菌后CAT活性變化

過(guò)氧化氫是生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的代謝廢物，其大量的累積能夠?qū)C(jī)體細(xì)胞造成嚴(yán)重的損害，為了避免這種損害，過(guò)氧化氫必須被快速地轉(zhuǎn)化為其他無(wú)害或毒性較小的物質(zhì)，而過(guò)氧化氫酶就是常常被細(xì)胞用來(lái)催化過(guò)氧化氫分解的工具。當(dāng)生物體細(xì)胞被病原體感染時(shí)，過(guò)氧化氫酶活性則升高來(lái)分解微生物，從而提高機(jī)體抗病性[12]。如圖3所示，百香果品種接種病菌后CAT酶活性逐漸上升，其中黃果種酶活性較高，酶活性分別為2.65U·g-1、2.01U·g-1，并且在接種病菌7d后達(dá)到峰值，而其他的品種則在14d達(dá)到峰值。

2.5 不同百香果品種接種莖基腐病菌后SOD活性變化

超氧化物歧化酶(SOD)是一種含金屬的抗氧化酶，在活性氧清除反應(yīng)過(guò)程中第1個(gè)發(fā)揮作用,在抗氧化酶類(lèi)中處于核心地位,能將超氧物陰離子自由基(O2-)快速歧化為過(guò)氧化氫(H2O2)和分子氧。SOD是植物重要抗逆性指標(biāo)之一，在保護(hù)細(xì)胞免受氧損傷過(guò)程中具有十分重要作用[13]。由圖4可知，在接種病菌后，酶活性逐漸增加，黃果品種酶活性較高，酶活性迅速升高，在接種7d后達(dá)到峰值，其他品種則也是14d到達(dá)峰值。

圖2 接種病菌后不同百香果品種葉片POD活性變化

圖3 接種莖基腐病菌后不同百香果品種葉片CAT活性變化

圖4 接種莖基腐病菌后不同百香果品種葉SOD活性變化

2.6 不同百香果品種接種莖基腐病菌后PPO活性變化

多酚氧化酶是一種廣泛存在于植物各組織氧化酶，其是一種含銅離子膜蛋白結(jié)合酶，多酚氧化酶通過(guò)催化木質(zhì)素及醌類(lèi)化合物形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽而使細(xì)胞免受病菌侵害，也可以通過(guò)形成醌類(lèi)物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用[14,15]。由圖5可知，接種病菌后黃果品種明顯高于其他品種，所有品種都是在接種莖基腐病菌14d后酶活性達(dá)到最大值，“黔黃1號(hào)”及“芭樂(lè)味黃金果”酶活性最大，酶活性分別是3.13U·g-1、2.93U·g-1，兩者間酶活性差異顯著。“紫香1號(hào)”酶活性最小，酶活性為0.97U·g-1。

2.7 不同百香果品種接種莖基腐病菌后PAL活性變化

苯丙氨酸解氨酶(PAL)廣泛存在于植物中，其為植物體次生代謝的關(guān)鍵酶及限速酶，在植物體內(nèi)苯丙烷類(lèi)物質(zhì)代謝中起到關(guān)鍵酶作用，苯丙烷類(lèi)代謝進(jìn)一步形成咖啡酸、綠原酸、類(lèi)黃酮和木質(zhì)素等多種抗菌物質(zhì)的主要途徑，病原菌侵染和病原菌毒素處理都能誘導(dǎo)苯丙氨酸解氨酶活性增強(qiáng)，且酶活增強(qiáng)與抗病性成正相關(guān)[16-18]。如圖6所示，總體上說(shuō)，黃果品種的苯丙氨酸解氨酶活性高于紫果品種，最低是“綠皮荔枝味百香果”。接種莖基腐病菌后所有品種苯丙氨酸解氨酶均上升，并在14d達(dá)到最大值。

圖5 接種莖基腐病菌后不同百香果品種葉PPO活性變化

圖6 接種莖基腐病菌后不同百香果品種葉片PAL活性變化

3 結(jié)論與討論

在本試驗(yàn)分別通過(guò)對(duì)不同百香果品種葉片及莖基部接種莖基腐病菌后，不同百香果品種間菌斑長(zhǎng)度出現(xiàn)顯著性差異，菌斑較小的為黃果品種“黔黃1號(hào)”、“芭樂(lè)味黃金果”，其次為紫果品種“貴寒1號(hào)”、“臺(tái)農(nóng)1號(hào)”、“紫香1號(hào)”，菌斑最大的為綠果品種“綠皮荔枝味百香果”。感病指數(shù)最高的是“綠皮荔枝味百香果”，最低的是“黔黃1號(hào)”。與此同時(shí)，對(duì)6種不同品種百香果莖基部接種鐮刀菌后21d，分別對(duì)株高、莖粗、根系鮮重、根系干重、地上部分鮮重、根系體積、地上部分干重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組各項(xiàng)考察指標(biāo)均低于對(duì)照組，這說(shuō)明接種莖基腐病菌對(duì)百香果的生長(zhǎng)發(fā)育確實(shí)造成一定影響。接種后0d、7d、14d、21d的葉片取樣，對(duì)接種POD、CAT、SOD、PPO、PAL活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，抗性較強(qiáng)的黃果品種POD、CAT、SOD酶活性普遍比其它供試品種高，且峰值出現(xiàn)比其他紫果種和綠果種早。百香果不同品種對(duì)莖基腐病的抗性規(guī)律：黃果品種>紫果品種>綠皮品種；抗性越強(qiáng)的品種其5種防御酶活性普遍較高，且POD、CAT、SOD 3種酶活性出現(xiàn)峰值時(shí)間越早。