張文川，趙佳寶，王哲，楊向紅

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽 110004

世界衛(wèi)生組織（WHO）國際癌癥研究機構(gòu)公布了2020年全球癌癥負擔(dān)的最新數(shù)據(jù)，乳腺癌是全球最常見的惡性腫瘤，肺癌位居第二位，但肺癌仍居男性惡性腫瘤首位[1]，包括小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占全部肺癌的80%，病理類型主要包括腺癌和鱗狀細胞癌等。由于缺乏靈敏度較高的診斷方法，早期肺癌的診斷準(zhǔn)確度較低，導(dǎo)致患者確診時多已處于中晚期。目前，也仍然沒有特異性的肺癌篩查方法[2]，因此，迫切需要尋找更有效的早期肺癌篩查方法。

細胞學(xué)檢查是早期中心型肺癌的經(jīng)典篩查方法[3]，是評估肺部病變良惡性的一種簡單、可靠、經(jīng)濟、無創(chuàng)的方法；但由于痰細胞學(xué)檢查的靈敏度較低，肺癌篩查的成功率受到限制[4-5]。與其他侵入性手術(shù)相比，支氣管鏡檢查雖然也是一種微創(chuàng)技術(shù)，術(shù)后并發(fā)癥較少，但支氣管鏡檢查的診斷準(zhǔn)確度也相對較差，靈敏度為30%～69%[6]。因此迫切需要一種創(chuàng)傷小、診斷能力強的方法。生物標(biāo)志物在腫瘤的診斷中迅速發(fā)展，出現(xiàn)了一些有前景的候選分子，如DNA甲基化、補體片段、自身抗體、循環(huán)腫瘤DNA、微小RNA（microRNA，miRNA）及血液蛋白分析等，對肺癌的早期篩查具有重要意義。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，將甲基基團轉(zhuǎn)移到胞嘧啶堿基上的一種修飾方式，對基因表達的調(diào)控至關(guān)重要，DNA甲基化導(dǎo)致的表觀遺傳變化在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[7]。矮小同源盒2（short stature homeobox 2，SHOX2）和Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族蛋白1A（Ras association domain family protein 1A，RASSF1A）的甲基化研究現(xiàn)處于第三階段，即用于篩查背景下風(fēng)險管理（risk management in screening context，RMS）的后縱向研究階段，即將進入Ⅳ期臨床驗證水平[8]。有研究表明，SHOX2和RASSF1A的啟動子甲基化已被確定為肺癌診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物[9]。因此，支氣管抽吸物比傳統(tǒng)血液檢測診斷肺癌的效能更佳且細胞濃度更高，本研究采用循證醫(yī)學(xué)的方法量化評價支氣管抽吸物中SHOX2和RASSF1A基因甲基化對早期肺癌的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索

計算機檢索 PubMed、Embase、The Cochrane Library、Web of Science、Clinical Trail、CNKI、萬方數(shù)據(jù)庫，檢索時間自建庫至2021年5月11日，檢索語種為英文和中文，檢索詞包括主題詞和自由詞。中文檢索詞為“肺癌”“SHOX2”“RASSF1A”；英文檢索詞為“l(fā)ung neoplasms”“cancer of lung”“pulmonary neoplasms”“ras association(RalGDSAF-6)domain family 1 protein,human”“RASSF1A protein,human”“SHOT protein,human”“short stature homeobox 2 protein,human”。

1.2 文獻納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①SHOX2或RASSF1A甲基化診斷肺癌的原始文獻；②以肺癌病理檢查為診斷金標(biāo)準(zhǔn)；③真陽性例數(shù)、假陽性例數(shù)、假陰性例數(shù)和真陰性例數(shù)可直接或間接根據(jù)文獻計算；④隊列或病例對照研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①動物實驗；②病例報道；③部分或全部文獻數(shù)據(jù)出現(xiàn)在另一篇文章中；④非中文和英文文獻；⑤會議摘要、綜述、薈萃分析。

1.3 文獻篩選和數(shù)據(jù)提取

由兩名研究員分別獨立篩選標(biāo)題和摘要，并閱讀全文以確定合格的研究，如果存在爭議，則與第三名研究員協(xié)商一致解決分歧。研究資料包括：①作者、研究類型、國籍和年份；②甲基化陽性患者和陰性對照者；③SHOX2和RASSF1A甲基化的測定方法；④肺癌病理類型。對于數(shù)據(jù)不足的研究，向原作者發(fā)送郵件以獲取相關(guān)信息。

1.4 納入文獻偏倚風(fēng)險評價

由兩名研究員獨立進行文獻偏倚風(fēng)險評價，方法學(xué)質(zhì)量評價采用診斷準(zhǔn)確性研究質(zhì)量評價工具2（quality assessment of diagnostic accuracy studies-2，QUADAS-2）[10]評估，通過RevMan 5.4軟件對每項研究進行質(zhì)量評價。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Stata 16.0軟件進行Meta分析；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估各指標(biāo)診斷肺癌的靈敏度、特異度。通過Cochrane’s Q檢驗和Higgin I2評估各研究間的異質(zhì)性，當(dāng)I2≤50%或P＞0.10時，表明各研究間異質(zhì)性較小，采用固定效應(yīng)模型進行分析；當(dāng)I2＞50%或P＜0.10時，表明各研究間的異質(zhì)性較大，采用隨機效應(yīng)模型進行分析。采用單一敏感性分析，通過移除一項研究（每次一項）來確定其是否對總體結(jié)果有重大影響。此外，還對樣本量、NSCLC占肺癌的比例和種族人群進行亞組分析以進一步探討異質(zhì)性的來源。使用Deeks’漏斗圖驗證發(fā)表偏倚[11]。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果

本研究初步篩選出6067篇文獻，通過查閱標(biāo)題和摘要后篩選出27篇文獻，經(jīng)過全文復(fù)篩，最終納入20篇文獻（中文文獻8篇[12-19]，英文文獻12篇[20-31]），共4238例患者，其中病例組2328例，對照組1910例。

2.2 納入文獻基本特征及質(zhì)量評價

所有研究中，11項[12-22]在亞洲，8項[23-30]在歐洲，1項[31]在非洲，其中11項研究[12,14,16-17,19,22,25,28-31]中的2471例患者接受了SHOX2甲基化檢測，15項研究[12-20,22-27]中的3046例患者接受了RASSF1A甲基化檢測，5項研究[12,14,19,21-22]中的1469例患者同時接受了SHOX2和RASSF1A甲基化檢測。納入20篇文獻的基本情況見表1，采用QUADAS-2進行了質(zhì)量評估，結(jié)果見圖1。

圖1 QUADAS-2評價文獻質(zhì)量

表1 納入20篇文獻的基本情況

2.3 SHOX2甲基化、RASSF1A 甲基化單獨及聯(lián)合檢測對肺癌的診斷價值

SHOX2甲基化診斷肺癌的AUC為0.86，合并靈敏度為 0.73（95%CI：0.69～0.77），合并特異度為0.90（95%CI：0.86～0.93），陽性似然比和陰性似然比分別為7.50和0.30。RASSF1A甲基化診斷肺癌的AUC為0.82，合并靈敏度為0.51（95%CI：0.44～0.58），合并特異度為0.96（95%CI：0.93～0.98），陽性似然比、陰性似然比分別為14.10、0.50。SHOX2甲基化聯(lián)合RASSF1A甲基化診斷肺癌的AUC為0.90，合并靈敏度為 0.78（95%CI：0.73～0.82），合并特異度為0.87（95%CI：0.83～0.90），陽性似然比、陰性似然比分別為5.80、0.26。（圖2、圖3、圖4）

圖2 SHOX2甲基化診斷肺癌的森林圖

圖3 RASSF1A 甲基化診斷肺癌的森林圖

圖4 SHOX2和RASSF1A 甲基化聯(lián)合診斷肺癌的森林圖

分別依據(jù)樣本量、NSCLC占比、種族將SHOX2和RASSF1A甲基化對肺癌的診斷價值進行亞組分析。亞組1：樣本量＜200的亞組中，SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度分別為0.74和0.49，特異度分別為0.88和0.98；樣本量≥200的亞組中，SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度分別為0.72和0.53，特異度分別為0.91和0.96。亞組2：NSCLC占比＜80%的亞組中，SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度分別為0.75和0.49，特異度分別為0.88和0.97；NSCLC占比≥80%的亞組中，SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度分別為0.71和0.54，特異度分別為0.92和0.96。亞組3：亞洲人群的亞組中，SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度分別為0.73和0.57，特異度分別為0.89和0.93；在非亞洲人群亞組中，靈敏度分別為0.73和0.42，特異度分別為0.92和1.00。（表2）

表2 SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的亞組分析結(jié)果

2.4 敏感性分析

每次對參與Meta分析的單個研究進行評估，以反映單個數(shù)據(jù)集對靈敏度和特異度的影響，結(jié)果顯示，該Meta分析不受單個研究的影響，I2統(tǒng)計量也表明沒有一項研究影響了該Meta分析的異質(zhì)性。（表 3）

表3 SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的敏感性分析

2.5 發(fā)表偏倚

本研究評估了這20項研究中SHOX2和RASSF1A甲基化的發(fā)表偏倚，結(jié)果顯示本研究無明顯發(fā)表偏倚。

3 討論

3號染色體短臂等位基因缺失是肺癌發(fā)病機制中最常見、最早的事件之一，超過90%的SCLC和50%～80%的NSCLC中均有發(fā)現(xiàn)[32-33]。RASSF1A基因位于3號染色體p21.3（3p21.3）帶，是肺癌最小純合缺失的120 kb區(qū)域[34]。此外，RASSF1A是一個常見的異常甲基化基因，在肺癌中，RASSF1A啟動子在NSCLC和SCLC中的高甲基化率分別超過50%和79%[35-36]。這與本研究結(jié)果接近，即RASSF1A在NSCLC占多數(shù)的肺癌樣本中的靈敏度為0.51。RASSF1A亦是RAS的負效應(yīng)子，通常以其基因上4種主要的結(jié)構(gòu)域包括C1結(jié)構(gòu)域、RA結(jié)構(gòu)域、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變磷酸化位點和Salvador/RASSF/Hippo（SARAH）結(jié)構(gòu)域，通過幾種不同的通路包括蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）/促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）等，在腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，包括細胞凋亡、基因組和微管穩(wěn)定性及細胞周期調(diào)節(jié)。但RASSF1A高甲基化情況會發(fā)生反轉(zhuǎn)，肺癌中RASSF1A的缺失參與了肺癌分化程度的降低和干細胞特性的增強，是肺癌中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的必要條件。

SHOX2位于3號染色體（3q25.32）的長臂上，是同源盒家族成員。SHOX2編碼的DNA結(jié)構(gòu)域由60個氨基酸組成。SHOX2是一種致癌基因，是細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)因子和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的誘導(dǎo)因子。SHOX2基因中有3個CpG島，而這些CpG島的甲基化可以深刻影響SHOX2基因本身及其他相關(guān)基因的表達。同時，SHOX2基因的CpG島經(jīng)常被高甲基化，在腫瘤組織和細胞中高表達，如肺癌、乳腺癌、食管鱗狀細胞癌和肝細胞癌。在一些腫瘤中，SHOX2基因可通過參與調(diào)節(jié)成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）通路[包括RAS/ERK和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路、干細胞多能性相關(guān)信號通路等]、EGFR-酪氨酸激酶抑制劑抗性及細胞增殖、遷移、分化和細胞表型，抑制細胞抗凋亡作用，還可通過增加RUNX2激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路并抑制p53活性，導(dǎo)致致癌生物學(xué)過程的發(fā)生。有趣的是，SHOX2能夠與轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）受體結(jié)合，并與NF-κB信號通路相互作用，與RASSF1A相互調(diào)控。因此，RASSF1A和SHOX2與Hippo、NF-κB和 TGF-β通路密切相關(guān)。有證據(jù)表明，RASSF1A和SHOX2的甲基化在肺癌的發(fā)生發(fā)展中是一個關(guān)鍵事件，是診斷肺癌的重要生物標(biāo)志物，且對疑似肺癌患者的早期篩查非常有用[9,37]。目前研究顯示，表現(xiàn)出RASSF1A和SHOX2高甲基化的肺癌患者，組織學(xué)分化更差、臨床分期更晚、易局部復(fù)發(fā)，并明顯縮短了患者的總生存期和無病生存期，因此，甲基化檢測能為患者個性化治療選擇提供參考，對預(yù)測患者預(yù)后和監(jiān)測疾病發(fā)生發(fā)展有重要的臨床意義。

血漿中SHOX2甲基化診斷肺癌的靈敏度為60.0%，血清或痰樣本中RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度和特異度僅為45%，診斷效能并不高，而本研究在支氣管抽吸物中發(fā)現(xiàn)，SHOX2和RASSF1A診斷肺癌的靈敏度和特異度均高于痰液或血液，這可能與樣本來源密切相關(guān)。支氣管抽吸物中肺泡腺上皮含量較多，檢測干擾少，標(biāo)本質(zhì)量較高。但在其他文獻中，結(jié)果還存在相當(dāng)大的爭議。本研究對支氣管抽吸物中SHOX2和RASSF1A甲基化對早期肺癌的診斷價值進行Meta分析，結(jié)果顯示，SHOX2甲基化診斷肺癌的合并靈敏度和特異度分別為0.73和0.90，RASSF1A甲基化診斷肺癌的合并靈敏度和特異度分別為0.51和0.96，SHOX2和RASSF1A甲基化聯(lián)合診斷肺癌的合并靈敏度和特異度分別為0.78和0.87。雖然聯(lián)合診斷的特異度有所降低，但降低幅度很小并提高了整體靈敏度。本研究也有其不足和局限性，首先，由于本研究納入的文獻數(shù)量較少，可能無法全面評估SHOX2基因甲基化與肺癌間的真實關(guān)聯(lián)，并可能對本研究結(jié)果產(chǎn)生影響，有必要進一步擴大樣本量，以提供更具代表性的統(tǒng)計數(shù)據(jù)；作為回顧性研究，Meta分析可能存在選擇偏倚，可能影響研究結(jié)果。鑒于此，本研究結(jié)論尚需加大樣本量證實。

綜上所述，支氣管抽吸物中SHOX2和RASSF1A甲基化對肺癌的診斷價值較高，對CT檢查可疑肺癌的患者，是肺癌早期篩查的重要手段。對于疑似肺癌且支氣管鏡檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤的患者，進行支氣管抽吸物SHOX2和RASSF1A甲基化檢測對肺癌的早期診斷和預(yù)防具有重要意義。